介绍一个与材料相关的研究型综合化学实验*——壳聚糖的制备与表征

黄微

介绍一个与材料相关的研究型综合化学实验*
——壳聚糖的制备与表征

黄微

在中国科学技术大学夏季学期的研究型实验课程“化学科研基础训练”中开设“壳聚糖的制备与表征”综合实验，以龙虾壳为原料，通过除蛋白、脱盐、脱色、脱乙酰等一系列反应，制备得到目标产物壳聚糖。运用红外光谱、核磁共振仪、黏度法、滴定等对产品的结构及性能进行表征。

龙虾壳 壳聚糖 制备表征 研究型 综合化学实验

壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的甲壳素(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖[1]。该天然多糖具有优异的血液相容性、生物官能性、安全性、可降解性等，已成功应用于医药、食品、化工、污水处理、金属提取及回收、生物医学工程等诸多领域，是目前应用最为广泛的材料之一[2-6]。

关于壳聚糖的制备已有诸多文献报道[7-8]，但将其作为一个完整的研究型化学实验项目引入至本科实验教学还较为少见。在中国科学技术大学夏季学期的研究型实验课程“化学科研基础训练”中，我们将其作为实验项目之一，为学生开设了“壳聚糖的制备与表征”综合实验。让学生在教师指导下，进行壳聚糖相关文献的检索、方案设计、实验实施、报告撰写、结题答辩，较为完整地进行一次简单的科研实践过程。该实验时长为3周，计40学时、1学分[9]。下面对该实验的教学过程进行简单介绍。

1 实验目的

① 了解壳聚糖的性质及应用。

② 学习利用龙虾壳制备壳聚糖的原理及方法。

③ 学习利用红外、核磁、乌氏黏度计等仪器表征物质结构的方法。

④ 学习文献检索以及科技论文的撰写。

2 实验原理

龙虾壳中甲壳素含量为20%～30%，有机物(以蛋白质为主)含量约30%，无机物(以碳酸钙为主)含量约40%[10]。因此由虾壳制备甲壳素的过程，实际就是将甲壳素与蛋白质和无机盐分离的过程。根据甲壳素不溶于稀碱及稀酸的特性，可采用碱浸、酸浸的方法依次破坏虾壳中的蛋白质和碳酸盐。此外，虾壳中含有的大量色素(虾红素)会影响产品的表观和纯度，可采用无水乙醇回流除去，再利用高锰酸钾溶液将残留色素氧化，随后加入适量硫代硫酸钠溶液以除去残余高锰酸钾，干燥得到甲壳素，再进一步通过脱乙酰反应制备得到壳聚糖。甲壳素与壳聚糖的结构式如图1所示。

图1 甲壳素与壳聚糖的结构式

3 试剂仪器

3.1 试剂

虾壳取自合肥市龙虾一条街的饮食抛弃物，剔去残肉，洗净晾干备用。

NaOH溶液(0.1 mol/L、2.5 mol/L、10 mol/L)，HCl溶液(0.1 mol/L、1 mol/L)，乙醇，1% KMnO4溶液，2% Na2S2O3溶液，3% HAc溶液，0.2 mol/L NaCl-0.1 mol/L HAc混合溶液，1% I-KI溶液。

3.2 仪器

行星式球磨粉碎机(南京新校园仪器厂，型号PM2L)，IKA磁力搅拌器(德国IKA公司，型号RCT-basic)，离心机(德国Sigma公司，型号3K18)，傅立叶红外光谱仪(美国ThermoFisher公司，型号Nicolet 6700)，核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司，型号UitraShied 300M)，乌氏黏度计(上海申谊玻璃制品有限公司，毛细管直径0.4～0.5 mm)。

4 实验步骤

4.1 壳聚糖的制备

4.1.1 甲壳素的制备

① 粉碎虾壳：将龙虾壳洗净、烘干，以球磨机粉碎，备用。

② 除蛋白、脂肪：称取粉碎的虾壳100 g，置于1000 mL烧杯中，加入2.5 mol/L NaOH溶液400 mL，室温下搅拌12 h。

③ 除盐：将虾壳水洗至中性，稍沥干，加入1 mol/L HCl溶液500 mL，室温下搅拌6 h，再进行碱浸、水洗、酸浸、水洗，重复两次，用清水洗至中性。

④ 脱色：将上述产品用乙醇回流2 h，过滤，收集固体，并用1% KMnO4溶液浸泡1 h，过滤清洗，再加入2% Na2S2O3溶液浸没样品，逐滴加入1 mol/L HCl溶液，搅拌至紫色褪去，得到甲壳素，过滤清洗，烘干。

4.1.2 壳聚糖的制备

壳聚糖为甲壳素脱除乙酰基的产品，具有溶液黏稠、易成膜等特点。甲壳素在脱除乙酰基的同时会引起相对分子质量降低，因此在实验中要根据实际需要调控反应条件，其制备过程如下：

在氮气保护下，将5.0 g甲壳素加入到100 mL 10 mol/L的NaOH水溶液中，在100 ℃回流3 h，过滤，滤渣水洗至中性后，用3% HAc溶液搅拌溶解，过滤得上清液，再用NaOH溶液调节pH至9，逐渐析出胶状物，离心分离，产物干燥后即得到壳聚糖。

实验流程如图2所示。

图2 由龙虾壳制备壳聚糖的实验流程图

4.2 壳聚糖的表征

4.2.1 壳聚糖结构表征

采用傅立叶红外光谱仪以及核磁共振仪表征壳聚糖结构。其中，红外光谱测试采用KBr压片法；核磁共振测试以TMS为内标、DCl/D2O (V(DCl)∶V(D2O)=4%)为溶剂。

4.2.2 壳聚糖相对分子质量测定

4.2.3 壳聚糖脱乙酰度测定

依据壳聚糖的游离氨基能吸附碘分子并呈现亮紫色的特性[12]，以碘作指示剂，采用酸碱滴定法测定壳聚糖脱乙酰度。

准确称取0.3 g干燥至恒重的壳聚糖于250 mL锥形瓶中，加入30 mL 0.1 mol/L HCl标准溶液，室温搅拌至完全溶解，加入10 mL蒸馏水稀释，滴加2～3滴1% I-KI溶液。用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至刚出现亮紫色颗粒状沉淀，即为滴定终点，平行测定3次，按以下公式计算脱乙酰度(DD)[13]。

(1)

(2)

式中w(NH2)为—NH2的质量分数；c1为标准盐酸溶液浓度(单位为mol/L)；V1为加入的标准盐酸溶液体积(单位为mL)；c2为标准氢氧化钠溶液浓度(单位为mol/L)；V2为消耗的标准氢氧化钠溶液体积(单位为mL)；G为样品质量(单位为g)；161为壳聚糖结构单元对应的摩尔质量(单位为g/mol)；9.94%为DD=100%的壳聚糖中的氨基含量。

5 结果与讨论

5.1 壳聚糖结构表征

图3为在上述实验条件下制备的甲壳素和壳聚糖的红外谱图。其中，甲壳素(图3a)各主要峰归属如下：1654 cm-1出现的峰为酰胺Ⅰ带特征吸收峰(C—O伸缩振动)，1568 cm-1出现的峰为酰胺Ⅱ带特征吸收峰(N—H弯曲振动)，1320 cm-1出现的峰为酰胺Ⅲ带特征吸收峰(C—N伸缩振动)。与甲壳素的红外谱图相比，在壳聚糖的红外谱图中(图3b)，1654 cm-1的酰胺Ⅰ带吸收峰明显减弱，而在1572 cm-1处出现了很强的游离氨基振动吸收峰(N—H面内弯曲振动)，说明甲壳素成功脱除乙酰基。

图3 甲壳素(a)和壳聚糖(b)的红外谱图

图4为制备的壳聚糖样品的核磁氢谱，各峰归属如下：δ: 2.68(H2)，3.25～3.45(H3, H4, H5, H6)，4.42(H1)。δ=1.82处出现的极弱峰归属为乙酰基的甲基氢质子，说明脱除乙酰基较为完全。核磁与红外结果相吻合。

图4 壳聚糖的核磁氢谱

5.2 壳聚糖相对分子质量的测定结果

在该实验条件下制备的壳聚糖相对分子质量为4.35×104。在进行相对分子质量和脱乙酰度测定实验时，要注意壳聚糖样品的充分干燥，尤其是在对相对分子质量较高的高脱乙酰度壳聚糖样品进行测量时，由于其黏度较高，所用样品量较少(30～50 mg)，称量误差会导致测量结果出现较大波动，重现性差。在本实验条件下得到的是中低相对分子质量(1×104～1×105)的壳聚糖，黏度相对较低，测量用量较大(0.3～1.0 g)，称量误差对测定结果影响较小，重现性好。

5.3 壳聚糖脱乙酰度的测定结果

根据式(1)、式(2)计算得到该实验条件下制备的壳聚糖脱乙酰度为94.2%，与红外、核磁结果所呈现的趋势相符。酸碱滴定法是测定壳聚糖脱乙酰度较为简便的方法，具有成本低廉、快速准确等特点。本实验所制备的壳聚糖特性黏度仅为37.3，属低黏度壳聚糖，水溶性较好，因此在采用酸碱滴定法测定壳聚糖脱乙酰度时，即便在接近滴定终点时，体系也基本能保持较为澄清的溶液状态；此外，实验中采用I-KI为指示剂，终点时稍过量的氢氧化钠与壳聚糖的—NH3+(由壳聚糖的—NH2与盐酸结合而成)反应生成游离的—NH2，进而与碘分子形成明亮的紫红色n-σ型电荷转移络合物，振荡不消退，使终点易于观察。

6 注意事项

① 在甲壳素脱除乙酰基制备壳聚糖的实验过程中使用了热的浓碱溶液，应避免灼伤。

② 实验后应回收酸碱废液，不可随意排放。

③ 在进行相对分子质量和脱乙酰度测定实验时，要注意将样品充分干燥。

7 教学建议

① 壳聚糖相对分子质量以及脱乙酰度的变化对其晶体结构、水溶性、成膜性能、降解速率等均有显著影响[14]，学生可采取以小组为单位的方式，设计单因素分析法的实验方案，分别从反应时间、反应温度、体系pH的调控等方面进行考察，设计实验，并分析各种因素的影响规律。

② 测定壳聚糖脱乙酰度的方法较多，主要分为三大类，第一类是利用胺基的化学性质，如易质子化、易与醛基反应生成希夫碱等，可采用酸碱滴定法、电位滴定法、胶体滴定法等进行脱乙酰度的测定；第二类是利用胺基以及甲壳素/壳聚糖的波谱学特性，如酰胺基团在紫外光谱、红外光谱中的特征吸收峰等，可采用红外光谱法、紫外光谱法、核磁共振波谱法等进行脱乙酰度的测定；第三类是采用破坏样品法，即元素分析法、色谱法、热分析法等进行脱乙酰度的测定[15-16]。在实验过程中，学生可采取横向合作的方式，采用不同方法测定脱乙酰度，并比较各种方法的最佳适用体系及优劣性。

③ 实验报告以论文的形式完成，以达到综合考察学生撰写科技论文的目的。报告正文包括:实验背景介绍及原理；采取的研究方法和技术路线；实验结果与数据分析；实验总结与改进。

8 实验总结

本文介绍的“壳聚糖的制备与表征”实验涉及了球磨机的使用，氮气保护下的热回流装置的搭建，核磁、红外光谱分析，以及黏度、脱乙酰度测定等相关知识和技能，是一个集制备和表征为一体的研究型综合化学实验。在实验设计与实施过程中，学生运用所掌握的知识和技能，将饮食废弃物虾壳变为具有应用价值的壳聚糖，在熟悉的生活情境中感悟化学的魅力，认识与领悟化学和社会生活的联系，提升实验兴趣。此外，由于实验方案为学生查阅文献后自行设计，他们期待通过实验现象和实验数据来验证方案的合理性，因此学生对于问题的发现、分析和解决均表现出较强的欲望，再加上教师的适时指导和启发，他们的求知欲和实验积极性均得到较好提升。该实验原料经济易得、趣味性强、反应条件温和、重现性好，已在“化学科研基础训练”课程中连续向3届学生开设，取得了较好的教学效果，是一个适合低年级本科生的研究型综合化学实验项目。

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A Research-oriented Comprehensive Experiment Related to Materials*——The Preparation and Characterization of Chitosan

Huang Wei**Li Weiwei Zheng Yuan

(ChemistryExperimentTeachingCenter,UniversityofScienceandTechnologyofChina,Heifei230026,Anhui,China)

"The preparation and characterization of chitosan" was set up as a research-oriented comprehensive experiment in the course of Primary Training of Chemical Research in the summer semester of USTC. With the local lobster shell as the raw material, we inquired into the preparation of chitosan after a series of reactions such as deproteinization, desalination, decoloration and deacetylation. The physicochemical properties of chitosan were characterized by FT-IR,1H-NMR, viscosity measurement and titrametry.

Lobster shell; Chitosan; Preparation and characterization; Research-oriented; Comprehensive chemical experiment

10.3866/pku.DXHX20150657

*通讯联系人, E-mail:hwnk@ustc.edu.cn 李维维 郑媛 (中国科学技术大学化学实验教学中心 安徽合肥 230026)

2013年安徽省重大教学改革项目(No.2013zytz003); 2012年安徽省教学研究项目(No.2012jyxm020); 2014年度中国科学技术大学本科教学研究项目

O6-3; G64