外源性激素对异种移植后人胎卵巢组织的影响

童月红，周颖，吴丹丹，傅晓艳

（1.金华市中心医院 妇产科，浙江 金华 321000；2.温州医科大学附属第一医院 生殖医学中心，浙江温州 325000；3.金华市职业技术学院 解剖学教研室，浙江 金华 321000）

卵巢组织冷冻移植技术的发展为保存女性的生殖及内分泌功能提供了可能。但卵巢组织的来源极为有限，无法满足如卵巢早衰等患者的自体卵巢组织冷冻移植的需求。冻融人胎卵巢组织进行移植可成为解决这一问题的有效途径，但将其应用于临床尚需大量的实验研究。本研究以裸鼠异体移植作为实验模型，比较不同的外源性促性腺激素作用方式对冻融人胎卵巢组织异种移植后卵泡发育的影响，为其将来作为移植供体的可行性提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 经温州医科大学伦理委员会批准收集引产的女性胚胎卵巢（由温州医科大学附属第一医院分娩室提供，并与家属签署知情同意书）6例，胎龄为28～35周。本实验选用雌性裸鼠（BACLB/CA/nu-nu，购自中科院上海实验动物中心）54只，6～8周龄，体质量17～23 g，平均（20±3.15）g，饲养于温州医科大学实验动物中心。实验动物按不同外源性促性腺激素给予方式（A、B、C）及不同时期（分别为10～14周、18～22周、26～30周）回收移植物分为9组，每组6只，共54只。

1.2 主要试剂 Leibovitz-15（购自Sigma公司），丙二醇（PROH）（购自Sigma公司），孕马血清促性腺激素（PMSG）（购自宁波第二激素厂），人绒毛膜促性腺激素（hCG）（购自丽珠集团），Bolin固定液、增殖细胞核抗原（PCNA）试剂盒（由北京中杉金桥生物技术有限公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 人胎卵巢组织的冻融：获取的卵巢组织室温下Leiboviz-15基础培养液中切成约2 mm×3 mm×3 mm小块，组织立即于Bolin液中固定为新鲜组。其余组织块置于含1.5 mL PROH冷冻保护液的冷冻管中，采用Oktay等[1]提出的慢速冷冻快速复温法操作，解冻后组织块于Bolin液中固定为冻融组，其余组织切成约1 mm3大小用于移植，为移植组。

1.3.2 去势及移植手术：腹腔麻醉后，去除裸鼠双侧卵巢，暴露肾脏，分别于双侧肾被膜下各移入1块组织。冻融人胎卵巢组织异种移植后将实验动物随机分为3组（每组各18只），A组：移植术后4周开始每只隔日PMSG 5 IU经腹腔注射至取材；B组：取材前14 d开始每只隔日经腹腔注射PMSG 5 IU，直至取材，共7次；C组：移植术后4周开始等量0.9%氯化钠溶液隔日经腹腔注射至取材。分别于术后10～14周、18～22周、26～30周回收移植物，取材前36 h腹腔注射hCG 5 IU，回收的移植物立即置于Bolin溶液中固定。

1.3.3 卵泡计数：新鲜和移植后取回的卵巢组织固定Bolin液中作石蜡包埋，连续切片，厚度5μm，用苏木素-伊红染色。按Gougeon[2]卵泡分类标准进行卵泡计数：单层扁平或扁平与立方混合的前颗粒细胞包绕卵母细胞为原始卵泡；单层立方形颗粒细胞包绕中间的卵母细胞为初级卵泡；两层或以上立方形颗粒细胞包绕卵母细胞，无窦腔形成为次级卵泡；两层以上的颗粒细胞，卵泡内有窦腔形成为窦卵泡。原始卵泡：高倍镜400倍下随机观察10个视野，计数每隔10张切片中的卵泡数。初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡：分别计数所有切片中各阶段卵泡总数。1.3.4 PCNA免疫组织化学分析：移植后回收的卵巢组织常规固定包埋，5μm连续切片，每隔10张切片取一张，按试剂盒说明进行免疫组织化学染色，苏木素复染。结果判断：PCNA定位于细胞核内，阳性呈棕褐色，阴性呈蓝色。每张切片在400倍视野下计数5个视野，每个视野100个以上阳性细胞，计算阳性指数（阳性指数=视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×100%）。

1.4 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计学软件对数据进行分析。新鲜组和冻融组卵巢组织内卵泡计数以 ±s表示，采用配对样本t检验，各移植组间卵泡计数及PCNA阳性指数则采用多组等级资料的Kruskal-Wallis秩和检验，如差异有统计学意义，再进一步进行3组样本秩和的两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新鲜组和冻融组人胎卵巢组织形态学观察

新鲜组及冻融组人胎卵巢组织中的卵泡均以原始卵泡为主，分布较均匀，绝大部分形态正常，部分原始卵泡的卵母细胞胞浆内有空泡形成，可见卵原细胞散在分布，未见初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡。冻融组的原始卵泡数量为（30.10±9.44）个，比新鲜组的（37.26±8.91）个少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 移植组的检测

2.2.1 移植物的存活：整个实验中无动物死亡。取材时可见肾被膜下移植物凸出肾脏表面，体积不同程度增大，呈亮白色，部分可见透明窦状小泡（见图1）。A、B、C各组移植物回收率分别为88.9%（32/36）、86.1%（31/36）、88.9%（32/36），存活率分别为75.0%（27/36）、77.8%（28/36）、75.0%（27/36），3组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.2 卵泡计数：3组移植物中的原始卵泡数与新鲜组及冻融组相比均减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组移植物随着移植时间的延长，卵泡呈现原始卵泡数目减少及生长卵泡增加趋势。A组：与10～14周相比，26～30周移植物中的原始卵泡数减少而次级卵泡数增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。B组：各时期原始卵泡数差异无统计学意义（P＞0.05）；与10～14周及18～22周相比，26～30周移植物中的初级卵泡数及次级卵泡数均增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。C组：各时期移植物中原始卵泡数及次级卵泡数变化差异无统计学意义（P＞0.05）；与10～14周相比，18～22周及26～30周移植物中的初级卵泡数增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。

移植早期（10～14周）：A、B、C 3组均可观察到初级卵泡（见图2）及次级卵泡（见图3）。移植中期（18～22周）：与移植早期相比，3组移植物中的原始卵泡数、初级卵泡数及次级卵泡数差异均无统计学意义（P＞0.05）；A、B 2组各观察到2个和1个窦卵泡（见图1-4）。移植晚期（26～30周）：同期B、C组移植物中的原始卵泡数较A组多，差异有统计学意义（P＜0.05）；3组移植物中的初级卵泡数比较差异无统计学意义；同期A、B组移植物中的次级卵泡数较C组多，差异有统计学意义（P＜0.05）；且此期A、B、C 3组分别可见1个、2个、1个窦卵泡。各组各期原始卵泡计数具体见表1，初级卵泡计数见表2，次级卵泡计数见表3。

2.2.3 PCNA的免疫组织化学检测：3组的移植物中呈棕褐色的阳性细胞主要表达于初级卵泡、次级卵泡颗粒细胞及卵细胞核内；组织间质中也可见较多阳性表达细胞存在；偶见原始卵泡中体积增大、呈立方形的前颗粒细胞呈阳性表达（见图5-6）。定位阳性表达细胞于初级卵泡、次级卵泡颗粒细胞及卵细胞核，A、B、C 3组移植物PCNA阳性指数分别为55%～88%、52%～85%、46%～80%，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

在卵巢组织的冷冻研究中，采用冷冻剂PROH及程序化冷冻法[3-4]，可获得较为稳定的效果。本实验结果也证实冻融后人胎卵巢组织中仍存大量的原始卵泡，移植后卵泡的生长及PCNA的良好表达也进一步证实组织功能的完整性。但本研究结果示人胎卵巢组织移植后丧失的原始卵泡达50%以上，与成年[5]及青春前期[6]的人卵巢组织相比有差距，如何提高移植后组织内的卵泡的数量我们将继续研究。

表1 各组不同时期回收移植物中的原始卵泡数计数（ ±s，个）

表2 各组不同时期回收移植物中的初级卵泡计数（ ±s，个）

表3 各组不同时期回收移植物中的次级卵泡计数（ ±s，个）

图1 回收的人胎卵巢组织（T示移植物，其中可见窦卵泡，K示裸鼠肾脏）

图4 术后22周回收移植物内可见窦卵泡发育（HE，×200）

图2 术后10周回收移植物内可见初级卵泡（HE，×400）

图5 A组18周回收移植物的PCNA染色（×400）

图3 术后14周回收移植物内可见次级卵泡（HE，×400）

图6 C组18周回收移植物的PCNA染色（×400）

人胎卵巢组织中存在的大量原始卵泡，且组织中所含较低的人类器官移植相关的抗原及较高的血管源性和神经源性因子，适用于异体移植。目前人胎卵巢研究的重要问题是促进更多数量卵泡的成熟发育及延长移植物存活时间。移植物的激素环境是影响卵泡发育的重要因素。既往关于外源性促性腺激素方案与异体移植后卵巢组织内卵泡发育的实验结果存在矛盾，因研究物种及选择激素作用方式的不同相关。Pisani等[7]在以SCID鼠为模型的猪卵巢同种异体移植实验中，持续作用的外源性促性腺激素对卵泡的发育并没有显示出显著作用；Gook等[8]卵巢异种移植中却显示外源性促性腺激素可促进组织中更多卵泡发育。为探索外源性促性腺激素对人胎卵巢组织异种移植的影响，本实验设计了两种不同的激素作用方式，一种是根据文献报道所采用的外源性促性腺激素持续作用方式（即A组采用的方式），另一种是试图模拟成人促排卵激素作用方式（即B组采用的方式）。实验结果显示，即使缺乏外源性促性腺激素作用，卵泡仍能发育至窦卵泡阶段；不管何种作用方式，外源性促性腺激素对异种移植后人胎卵巢组织中卵泡生长的促进作用，不同于Pisani等[7]研究，与Gook等[8]结果类似，且外源性激素对初级卵泡以上的卵泡生长促进作用更为显著。推测原因为异种移植的人胎卵巢组织中大部分为原始卵泡，该阶段卵泡需经非激素依赖生长启动阶段，外源性促性腺激素持续作用主要作用于卵泡生长启动后阶段，对两层颗粒细胞以上的卵泡起关键作用，故在卵泡生长启动前阶段其促生长作用是有限的。但本实验观察到，人胎卵巢组织长期移植后存在一定数量的生长启动卵泡及初级卵泡，由于外源性促性腺激素持续作用和促排卵激素作用方式都主要作用于此类卵泡，故二者均获得较好的卵泡发育结果。由于部分学者[9]认为外源性激素在卵巢移植过程中发挥促进颗粒细胞的有丝分裂及抑制凋亡的作用，同时对卵巢间质细胞分化起作用[10]，因此尽管外源性促性腺激素持续作用与促排卵激素作用方式没有差别，所以有学者仍建议长期采用该方式。但本实验中两种激素作用方式下的PCNA阳性差异也不明显。又有学者[11]提出，外源性促性腺激素的长期使用会大量消耗移植组织内原始卵泡储备，造成移植物维持时间的缩短。本实验还观察到，移植后期外源性促性腺激素持续作用后组织中的原始卵泡数下降，而促排卵激素作用方式下的组织中原始卵泡数变化相对不明显。故虽两种激素作用者均可获得较好的卵泡发育结果，但促排卵激素作用方式对原始卵泡储备造成的影响可能更小。

综上所述，去势的雌性裸鼠体内的促性腺激素水平已达卵泡发育所需，外源性促性腺激素持续作用方式及促排卵激素用方式均可进一步促进异种移植后冻融人胎卵巢组织中卵泡的发育。但本实验最终均未见黄体组织，需考虑移植后组织中的窦卵泡是否存在成熟及排卵障碍，而不同的激素作用方式对卵子质量[12]的影响等问题均需进一步研究阐明。

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