皮肤黑色素瘤细胞中TGF-βRⅠ型和Ⅱ型受体表达的研究

郁 博，张 斌，苏 磊，潘 敏，陈宏泉△

(1.青岛大学附属医院皮肤科，山东青岛266003；2.第三军医大学新桥医院皮肤科，重庆 400037)

皮肤黑色素瘤细胞中TGF-βRⅠ型和Ⅱ型受体表达的研究

郁 博1，张 斌2，苏 磊1，潘 敏1，陈宏泉1△

(1.青岛大学附属医院皮肤科，山东青岛266003；2.第三军医大学新桥医院皮肤科，重庆 400037)

目的 探讨转化生长因子β受体(TGF-βR)Ⅰ、Ⅱ型在皮肤黑色素瘤细胞中的表达情况。方法应用反转录-实时荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法，对TGF-βRⅠ、Ⅱ型的mRNA及其蛋白在人皮肤黑色素瘤A375细胞和人正常黑素细胞中的表达进行检测。结果A375细胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型的mRNA和蛋白表达均显著低于正常人黑素细胞。结论在黑色素瘤细胞的TGF-β/Smad信号通路中出现TGF-βR表达的下调，可能是皮肤黑色素瘤发病机制之一。

黑色素瘤；受体，转化生长因子β；黑素细胞

在皮肤肿瘤的致死率排名中，皮肤黑色素瘤一直高居首位。过去的50年间，其发病率增加超出6倍，黑色素瘤一旦发生转移，则预后极差，总体5年生存率小于5%，中位生存期为6～10个月。其病理变化表现为黑素细胞失控性增殖。转化生长因子β (transforming growth factor-β，TGF-β)是一种具有多项生物学作用的细胞因子。它广泛存在于体内，对大多数上皮细胞具有生长抑制作用。TGF-β通过其受体(TGF-βR)来发挥重要生物学作用。有研究显示，在眼葡萄膜黑色素瘤组织中存在TGF-βR的表达异常[1-2]，提示TGF-β信号转导途径的改变与黑色素瘤的发生和发展有较为密切的关系。在人黑色素瘤组织中是否存在TGF-βR的表达异常？本实验以体外培养的人恶性黑色素瘤A375细胞为研究对象，采用反转录-实时荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)方法对其TGF-βRⅠ、Ⅱ的mRNA及其蛋白在人皮肤黑色素瘤A375细胞和人正常黑素细胞中的表达分别进行检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 (1)细胞：人黑色素瘤细胞A375细胞系(以下简称A375细胞)购自中国科学院上海细胞生物研究所。(2)主要试剂及仪器：DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM购自日本TaKaRa Bio株式会社，抗TGF-βRⅠ、Ⅱ多克隆抗体购自Santa Cruz公司，Chemi ImagerTM5500型凝胶成像分析仪购自美国Alpha Innotech公司，7500 Real Time 荧光定量PCR反应扩增仪购自美国Applied Biosystems公司，半干电转仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人皮肤黑素细胞提取参照文献[3]取健康成年人包皮(取自包皮环切术患者)进行消化、分离提取。黑素细胞、A375细胞培养条件为：5%CO2孵箱 37 ℃饱和湿度环境下孵育，含10%胎牛血清的DMEM培养，每2天更换1次培养液。

1.2.2RT-PCR检测 细胞总RNA提取参照Trizol(Invitogen公司)说明书操作步骤进行，并对所抽提的细胞总RNA质量进行验证。引物设计根据荧光定量PCR引物设计原则[4]。TGF-βRⅠ引物：上游为5′-GCA GTA AGA CAT GAT TCA GCC ACA G-3′，下游为5′-CAA TGG AAC ATC GTC GAG CAA-3′，扩增片段为190 bp；TGF-βRⅡ引物，上游为5′-TCG TCC TGT GGA CGC GTA TC-3′，下游为5′-GAA ACT TGA CTG CAC CGT TGT TG-3′，扩增片段为102 bp；内参校准基因GAPDH引物：上游为5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3′，下游为5′-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GT-3′，扩增片段：142 bp。反转录合成cDNA：根据RT Reagent Kit反转录试剂盒说明书，温度设定为42 ℃ 15 min，然后95 ℃ 2 min使反转录酶失活，所得cDNA产物保存备用于-20 ℃冰箱中。RT-PCR反应：50 μL反应体系内含模板cDNA 200 ng，扩增条件为95 ℃预变性10 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。分别设置融解曲线检测自65～95 ℃的融解温度，以验证产物的特异性。

1.2.3Western blot检测 参照文献[5]常规进行。分别取A375细胞(A375组)和正常黑素细胞(黑素细胞组)的总蛋白40 μg，上样至10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后，电转到PVDF膜上，再用5%的脱脂奶粉室温下封闭60 min，TBS洗膜，分别加入用0.5%的BSA稀释的一抗(工作浓度为1∶200)，4 ℃孵育过夜后，TBS洗膜，加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育1 h，TBST(TBS+0.1%Tween20) 洗膜。此后按DAB显色试剂盒说明书操作显色。

2 结 果

2.1细胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA的表达检测 与A375组(设为100%)相比，黑素细胞组TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA的2-△△CT值分别为2.126±0.130、4.282±0.226。黑素细胞组的TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA表达量分别是A375细胞的(2.126±0.130)、(4.282±0.226)倍，A375组的TGF-βRⅠ、Ⅱ型mRNA表达水平显著低于黑素细胞组(P<0.05)，见图1、2。

a：P<0.05，与黑素细胞组比较。

图1 两组细胞TGF-βRⅠ型mRNA相对表达量比较

2.2细胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型蛋白质的表达检测 黑素细胞组、A375组TGF-βRⅠ型蛋白质相对表达量分别为0.669±0.078、0.413±0.067(t=2.654，P<0.05)。黑素细胞组、A375组TGF-βRⅡ型蛋白质相对表达量分别为0.831±0.167、0.212±0.056(t=5.668，P<0.01)。A375组中TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ蛋白质表达量明显低于黑素细胞组，见图3。

a：P<0.05，与黑素细胞组比较。

图2 两组细胞TGF-β RⅡ型mRNA相对表达量比较

图3 两组细胞TGF-βRⅠ、Ⅱ型蛋白质表达图

3 讨 论

TGF-β是一种多功能蛋白，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。TGF-β包括3个亚型，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3[6-7]。TGF-β可以与细胞表面的TGF-βR结合而激活其受体，从而启动了信号传导级联而导致多种生物化学变化。TGF-β具有Ⅰ型和Ⅱ型两种跨膜信号传递受体，其受体内部含有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。TGF-βR在机体组织、细胞中广泛分布。皮肤作为人体组织的最大器官，是TGF-β发挥作用的重要靶器官。

对于多种肿瘤的形成与发展，TGF-β可表现出截然相反的两种作用，在肿瘤发生的早期阶段表现抑制作用，而在肿瘤侵袭、转移及扩散的晚期阶段表现为促进及加剧的作用[8-9]。通过细胞处于G1期以其保持在非增殖状态，从而对肿瘤细胞发挥抑制作用。这种抑制功能是通过TGF-β/Smad信号通路转导TGF-βR和多种Smad蛋白来发挥的[10-11]。此外，激活某些重要的细胞周期关键基因会导致肿瘤细胞的生长抑制，也是因为这些关键基因是TGF-β/Smad信号通路的下游靶点[11-13]。另外，在正常上皮细胞中几种促进细胞周期停滞的基因的表达，也能被TGF-β所调控。肿瘤细胞趋于丧失TGF-β对肿瘤抑制作用的反应能力，从而加速了肿瘤的发生与进展。通过加速肿瘤新生血管的形成、免疫逃逸/抑制、增进肿瘤细胞与细胞外基质的相互作用来促进肿瘤的侵袭、扩散和转移，是TGF-β在促进肿瘤发生机制方面主要的作用[14]。

目前研究发现在恶性黑色素瘤组织中TGF-β/Smad信号通路中的多种重要成分-TGF-β、TGF-βR及部分Smad蛋白出现表达异常[1-2]，提示在黑色素瘤的发生和发展过程中，TGF-β/Smad信号转导途径的多个环节的改变可能是其发病机制的重要原因之一。本研究通过比较体外培养的人黑色素瘤A375细胞及人正常黑素细胞中TGF-βRⅠ、Ⅱ型基因及蛋白质的表达，发现A375细胞的TGF-βRⅠ、Ⅱ型的表达均出现明显降低。由于TGF-β信号是通过其受体-TGF-βR来介导的，TGF-βR的存在是TGF-β/Smads信号下传的必要条件，如果TGF-βR表达水平降低或丧失，则TGF-β信号传导受阻，无法发挥TGF-β维持细胞内环境稳定性。在癌基因启动和抑癌基因功能丧失等多种相关因素的共同作用下，黑色素瘤细胞自身出现TGF-β抑制作用缺失，可导致黑色素瘤细胞的特征性病理改变，出现异常黑素细胞的失控性异常增殖及浸润、扩散。因此，本实验为黑色素瘤细胞出现异常增殖的机制研究提供了一定的依据。

通过本实验研究，说明TGF-βR表达水平的降低可能既存在于机体的黑色素瘤组织中，也出现在体外培养的人黑色素瘤细胞株中。推测TGF-βR的异常表达可能参与了黑色素瘤的发生和发展过程中，也或许为黑色素瘤细胞本身内在所固有的表现。因此在体外培养条件下，人黑色素瘤A375细胞仍然持续表达此信号通路异常的特质。但机体黑色素瘤中TGF-βR表达降低的原因并不清楚，是否可以推测：黑色素瘤组织中存在多种促使或抑制黑素细胞生长、增殖、凋亡及分化的基因发生改变，而TGF-βR表达的降低可能是其中原因之一。在多种促癌基因和抑癌基因异常调节的协同作用下，异常黑素细胞出现失控性异常增殖。研究黑色素瘤细胞中的TGF-β/Smad信号转导的表达，是为进一步深入系统了解黑色素瘤的发病机制奠定基础。

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Research of expression of TGF-β receptorⅠ/TGF-β receptor Ⅱin skin malignant melanoma cells*

YuBo1,ZhangBin2,SuLei1,PanMin1,ChenHongquan1△

(1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266003,China;2.DepartmentofDermatology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the expression and significance of TGF-β receptor Ⅰ/TGF-β receptor Ⅱ(TGF-β Ⅰ/TGF-β Ⅱ) in human skin malignant melanoma A375 cell line.Methods The reverse transcription-real time polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were utilized to assess the expressions of TGF-βR Ⅰ/TGF--βR Ⅱ in A375 cell line and human normal melanocytes.Results The expressions of TGF-βR Ⅰ/TGF--βR Ⅱ mRNA and protein of A375 cells line were significantly lower than those of human normal melanocytes.Conclusion The down-regulated expression of TGF-βR in the TGF-β/Smad signal pathway of human skin malignant melanoma may be one of the pathogenesis of skin malignant melanoma．

melanoma;receptors,transforming growth factor beta;melanocytes

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.006

山东省科技发展计划资助项目(2011YD18012)；山东省自然科学基金资助项目(ZR2010HM022)；山东省中医药科技资助项目(2011-199)。

郁博(1976-)，副主任医师，博士后，主要从事黑色素瘤发病机制与TGF-β/Smad信号通路的研究工作。

△通讯作者，Tel：(0532)82911215；E-mail:chhq6198@163.com。

R332 R322.61

A

1671-8348(2015)11-1460-03

2014-07-11

2015-01-24)