大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的原代培养及鉴定

敖 锋 ，张自力 ，宋 健

·基础医学论著/研究·

大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的原代培养及鉴定

敖 锋1，2，张自力1，宋 健2

目的 探讨一种方便、快捷、大量原代培养大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的方法，为心血管疾病的体外研究提供可靠的实验材料。方法 利用改良的组织贴块法进行血管壁中膜平滑肌细胞原代培养，使用倒置相差显微镜观察细胞形态，并用免疫荧光染色鉴定分离培养的细胞。结果 改良的组织贴块法成功培养出大鼠血管壁中膜平滑肌细胞，3 d～5 d可见细胞爬出，7 d～9 d即可传代。镜下见细胞以长梭形为主，呈典型“峰-谷”样生长，免疫荧光染色鉴定阳性细胞率在95%以上。结论 本研究介绍的改良组织贴块法技术成熟，具有操作简单、方便等优点，使用该法不仅可以获得纯度高、活性好的血管中膜平滑肌细胞，而且缩短了培养周期。

血管壁；中膜；平滑肌细胞；原代培养

血管壁中膜平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)是构成血管壁组织结构和维持血管张力的重要成分之一，而SMC发生表型转换、迁移、异常增殖并分泌大量细胞外基质所引起的内膜增厚是高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等心血管疾病的核心病理过程[1-2]。因此，研究中膜SMC增殖、迁移的信号转导机制及寻找动脉粥样硬化等疾病的分子治疗靶点是当前心血管界的热点和难点[3]，而SMC的原代培养为进行心血管疾病的分子生物学机制体外研究、相关药理研究提供了有利的实验材料。笔者在对国内外同行研究深入分析的基础上对传统SMC培养方法组织贴块法进行改进，通过反复实践摸索建立出稳定、快捷、方便、高效的大鼠中膜SMC体外培养模型，并采用免疫细胞化学染色对其鉴定，纯度在95%以上。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康SD雌性大鼠，(2～3)月龄，体重150 g～200 g，由武汉大学医学部实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 DMEM/F-12液体培养基(Gibco公司)、青霉素(Amresco公司)、链霉素(Amresco公司)、Ⅱ型胶原酶(Worthington Biochemical公司)、β-巯基乙醇(Sigma公司)、谷氨酰胺(Thermo公司)、炭吸附特级胎牛血清(Biological Industries公司)、兔抗平滑肌肌球蛋白重链抗体(Abcam公司)、Hoechst(Sigma公司)、FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(Beyotime公司)等均通过商品化途径购置。

1.3 SMC的原代培养 按0.25 mL/100 g腹腔注射2%戊巴比妥钠，待大鼠麻醉后，无菌条件下迅速分离大鼠主动脉，置于盛有无菌D-Hank’s液(4 ℃预冷)的培养皿中清洗3次，清洗过程中同时剔除血管表面的脂肪组织、结缔组织以及血凝块。将主动脉转移至另一洁净盛有无菌D-Hank’s液(4℃预冷)的培养皿中，眼科剪剪开血管，无菌棉签沿血管纵轴来回擦拭主动脉内膜3次，以去除血管内皮细胞。从D-Hank’s液中取出主动脉，放入含有1 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶的EP管中，置于37℃水平摇床中消化12 min。显微镊小心撕下血管中膜，置入盛有完全培养基的培养皿中，用显微剪将中膜剪成1 mm×1 mm大小碎片，均匀摆置铺平于T25细胞培养瓶瓶底并在瓶内侧壁加入3 mL含10%胎牛血清的完全培养基。将培养瓶侧放竖立(见图1a)于37℃恒温、饱和湿度、5%CO2培养箱内放置1 h，然后翻转T25培养瓶使瓶底朝上(见图1b)再静置1 h～1.5 h。待观察到组织块稍变干与培养瓶底黏附后，缓慢将培养瓶翻转平放(见图1c)，绝对静置培养箱内3 d～5 d，期间禁止震荡或移动培养皿，以防贴壁的组织碎片脱落。5 d后每日用相差倒置显微镜观察细胞生长情况。

图1 T25细胞培养瓶摆放示意图

1.4 SMC的传代培养及纯化 当细胞生长达到亚融合状态(约80%融合)时即可进行传代培养。弃去旧培养基，37℃预热的无菌D-Hank’s液清洗细胞表面3次，清洗过程中晃动培养瓶以除去组织块和残余的血清。吸尽D-Hank’s液后，在细胞表面均匀地加入0.125%胰酶和0.02%EDTA的混合液600 μL，37℃条件下消化3 min。待显微镜下观察到大部分细胞收缩变圆从皿底脱落后，立即加入1.5 mL完全培养基中止消化反应，离心后按照1∶3的比例分瓶培养。

由于培养的细胞中可能含有成纤维细胞混杂生长，因此可采用差异贴壁法纯化中膜SMC[4]。即在传代时将细胞悬液静置(15～25)min，使成纤维细胞贴壁，转移培养液至另一个培养瓶中，再次静置贴壁，重复上述步骤(2～3)次即可获得纯化的平滑肌细胞。

1.5 SMC的鉴定 将传代时制备好的细胞爬片置于24孔板内，0.1 mol/L PBS浸洗细胞爬片5 min×3次；然后4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS浸洗5 min×3次。0.1%Triton X-100室温孵育10 min，PBS浸洗细胞爬片5 min×3次。5%BSA室温封闭30 min后吸尽封闭液，按照1∶50比例稀释一抗(兔抗平滑肌肌球蛋白重链抗体)，每张爬片滴加50 μL一抗，4℃湿盒内孵育过夜。次日，PBS浸洗细胞爬片5 min×3次，按照1∶200比例稀释带荧光的二抗(FITC标记的山羊抗兔IgG抗体)，湿盒内避光条件下室温孵育2 h。每张爬片滴加20 μL Hoechst染核2 min，PBS浸洗后甘油封片，荧光显微镜下采集图像。阳性染色以胞质出现绿色为标准，选择着色均匀的区域，在荧光显微镜40倍视野下计数绿色细胞占该视野细胞总数的百分比。每张切片选择6个视野，每组取6张切片，计算平均值。

2 结 果

2.1 SMC体外培养生长状况 改良的组织贴块法成功培养出大鼠血管壁中膜SMC，3 d～5 d见细胞从组织块边缘迁移萌出，细胞体积小，形态不一，大部分呈长梭形，少量呈三角形或不规则形，折光性强，胞质丰富。约7 d～9 d细胞生长致密成层，融合成片，呈典型“峰-谷”样生长状态时即可传代(见图2)。

a：原代培养第4天见组织块旁 b：原代培养第4天见爬出的细胞大部分呈 c：原代培养第7天见细胞呈典型 少许细胞爬出(×10) 长梭形，折光性强，胞质丰富(×20) “峰-谷”样生长(×40)

2.2 SMC的鉴定 培养的第3代SMC经平滑肌特异性蛋白-平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain，SM MHC)免疫化学染色后，正置显微镜下见SM MHC沿细胞纵轴呈肌丝状整齐排列于细胞质内，胞质呈绿色，细胞核呈卵圆形居中，阳性细胞率在95%以上(见图3)，这表明本方法分离培养的SMC纯度高。

a：绿色荧光表示SM MHC呈肌丝状 b：蓝色荧光表示Hoechst染核 c：a和b的融合图整齐排列于细胞质内(FITC标记)

3 讨 论

血管壁中膜SMC原代培养的方法主要有酶消化法和组织贴块法，酶消化法由于受中膜组织需求量大、得率低、消化步骤多、酶作用时间难以掌控、污染概率高等因素的影响[5]，限制了其广泛应用。目前，国内广泛应用的是组织贴块法，组织贴块法具有经济实用、操作简单、细胞活性好、得率高等优点，不足之处是培养周期长。本研究在传统组织贴块法基础上通过反复实践，并借鉴前人的经验，经过改良不仅缩短了培养周期，而且获得纯度较高的SMC。现就关键环节做以讨论。

3.1 动物及麻醉方式的选择 众所周知，年幼大鼠的组织块具有更强的增殖潜能，原代培养成活率更高，但体重太小的大鼠取材困难且细胞得量少[6]。经过反复摸索，本课题组认为选取(2～3)月龄、体重(150～200)g大鼠最为适宜，这样既方便操作，又保证细胞未过于老化。传统方法采用颈椎脱臼处死大鼠，这可能导致大鼠处死过久尚未完成取材。本研究采用麻醉动物的方法不仅减少了动物的痛苦，而且保证了组织的活性，减少组织变性，从而确保细胞活力。

3.2 取材要迅速并严格执行无菌操作 加强取材训练，尽量在30 min内完成从取材到贴壁的全过程，减少细胞活性的降低。麻醉后的大鼠用70%酒精消毒皮肤，剪开皮肤后更换一套消毒的器械，打开胸腔后再更换一套；获取大鼠主动脉时，采用消毒后纱布保护肺，避免损伤肺引起污染。

3.3 彻底去除血管内、外膜 用棉签擦拭内膜避免内皮细胞的污染，分离中膜，去掉外膜，避免了外膜成纤维细胞的污染。同时在传代时采用差异贴壁法进一步纯化了中膜SMC，保证细胞的高纯度。

3.4 组织碎片的选取及翻瓶方法 组织碎片一定要“剪”而不能“撕”，剪切时要轻柔，大小以1 mm×1 mm为最佳。组织碎片过小，操作频繁且损伤细胞较多，不利于其生长；组织碎片过大，SMC因营养摄取不足而迁出困难。组织碎片移入T25培养瓶后，文献多报道将有组织碎片的培养瓶底面朝上静置(2～3)h后再翻转培养瓶，使组织碎片与培养基接触。本课题组在实验中发现采用这种方法(2～3)h后组织碎片周围仍然很潮湿，组织碎片不能很好贴于瓶底，翻瓶后有多数组织碎片飘起。于是，改进为将培养瓶侧放竖立于培养箱内1 h，利用液体重力作用使瓶底和组织碎片周围的液体流至瓶底，然后翻转T25培养瓶使瓶底朝上再静置(1～1.5)h后，缓慢将培养瓶翻转平放。这样不仅减少翻瓶的等待时间(时间太长组织会干涸)，而且飘起的组织碎片极少。因此，组织碎片能够尽早接触培养基，有利于细胞更早迁出[7]。

本研究对传统的中膜SMC原代培养进行了改良，获得了较为理想的结果，该方法能为动脉粥样硬化等心血管疾病的病因、病理生理机制及防治研究提供理想的实验材料。

[1] Duran-Prado M，Morell M，Delgado-Maroto V，et al.Cortistatin inhibits migration and proliferation of human vascular smooth muscle cells and decreases neointimal formation on carotid artery ligation[J].Circ Res，2013，112(11)： 1444-1455.

[2] Choe N，Kwon JS，Kim JR，et al.The microRNA miR-132 targets Lrrfip1 to block vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia[J].Atherosclerosis，2013，229(2)： 348-355.

[3] Rivard A，Andres V.Vascular smooth muscle cell proliferation in the pathogenesis of atherosclerotic cardiovascular diseases[J].Histol Histopathol，2000，15(2)： 557-571.

[4] Jiang XY，Zhang L，Yu C，et al.Research for a better method of neonatal rat cardiac myocytes，primary culture and purification[J].Journal of Sichuan Unversity，2015，46(2)： 301-304.

[5] 倪伟，刘涛，王浩宇，等.酶联合消化法培养小鼠主动脉平滑肌原代细胞[J].西部医学，2013，25(7)： 968-970；973.

[6] 张浩，王志维，吴红兵，等.大鼠血管平滑肌细胞的培养和鉴定[J].武汉大学学报(医学版)，2014，(3)： 378-380.

[7] Metz RP，Patterson JL，Wilson E.Vascular smooth muscle cells： isolation，culture，and characterization[J].Methods Mol Biol，2012，843： 169-176.

(本文编辑 王雅洁)

Primary Culture and Identification of the Smooth Muscle Cells from the Medial of Vascular wall in Rats

Ao Feng，Zhang Zili，Song Jian Renmin Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China；Wuhan University School of Medicine，Wuhan 430071，Hubei，China

Corresponding Author：Song Jian(Wuhan University School of Medicine，Wuhan 430071，Hubei，China)

Objective To investigate the primary culture and identification of the smooth muscle cells (SMC) from the medial of vascular wall in rats.Methods SMC from the medial of vascular wall were cultured by modified tissue culture.The cellular morphology was observed under inverted phase contrast microscope.SMC were isolated and identified with immunofluorescence.Results SMC were isolated successfully and cultured.The cells had a typical peak-valley like growth，and showed fusiform.The positive rate of cells identified with immunofluorescence were more than 95%. Conclusion The modified tissue culture can isolate and cultivate SMC with high purity and good activity under in vitro conditions with simple，reliable method.

vascular wall； medial； smooth muscle cells； primary culture

国家自然科学基金面上项目资助(No.81170134)

1.湖北医药学院附属人民医院( 湖北十堰 442000)，E-mail：aofeng19841112@163.com；2.武汉大学医学院人体解剖学与组织胚胎学系

宋健，E-mail：songwhu@yahoo.com.cn

R54 R285

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.007

1672-1349(2015)17-1937-03

2015-07-01)