一测多评法同时测定金喉健喷雾剂中4种有效成分*

王俪瓯，杨娟艳，茅向军，杨微微，罗奕

一测多评法同时测定金喉健喷雾剂中4种有效成分*

王俪瓯1，杨娟艳3，茅向军2，杨微微1，罗奕1

(1.贵州医科大学药学院，贵阳 550004；2.贵州省食品药品检验所，贵阳 550004；3.贵阳中医学院，贵阳 550002)

目的 建立一测多评法的方法学考察模式，验证其在金喉健喷雾剂中应用的可行性和技术适应性。方法 采用气相色谱法，以萘为内标物，以薄荷脑为参照物，建立该成分与1，8-桉叶素，樟脑，龙脑的相对校正因子，并用该校正因子进行4种有效成分的含量测定，实现一测多评，同时采用对一测多评计算值与内标法实测值的进行比较，以验证一测多评法的准确性。结果 所建立的校正因子重复性良好，10批产品中4个指标成分的含量计算值与内标法实测值差异有统计学意义。结论 一测多评法作为一种新的质量评价方法用于金喉健喷雾剂4种有效成分含量测定是可行的、准确的。

金喉健喷雾剂；一测多评法；校正因子，相对；含量测定

金喉健喷雾剂是以苗药为基础制备而成的中药复方制剂，处方由艾纳香油、大果木姜子油、薄荷脑(menthol)、甘草酸单铵盐组成。主要功效祛风解毒、消肿止痛、清咽利喉，其中艾纳香油和大果木姜子油中的1，8-桉叶素(1，8-cineole)，樟脑(camphor)，龙脑(borneol)均为活性药理成分，原标准仅有以龙脑和薄荷脑的含量测定[1]。但是中药多成分、多功效的作用特点决定着单一成分或指标评价难以表达中药的质量，并由此提出多成分质量控制的模式。为了客观评价金喉健喷雾剂的质量，笔者采用气相色谱(gas chromatography，GC)法对两种以原料药的挥发油提取物投料的主药成分同时进行分离与检测，测定1，8-桉叶素、樟脑、薄荷脑、龙脑4种有效成分含量，并且引入“一测多评”法[2]以薄荷脑对照品为指标成分，建立1，8-桉叶素，樟脑，龙脑与薄荷脑的相对校正因子进行含量测定。目前 “一测多评”法应用于中药复方制剂较多使用的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法测定[3-9]，GC法测定仅有一篇报道[10]。笔者采用GC法将“一测多评”的方法应用于金喉健喷雾剂的质量控制中，对不同品牌的色谱柱进行考查，探讨一测多评法在金喉健喷雾剂质量评价中应用的可行性。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Ailgent 7890N气相色谱仪，Ailgent 7693自动进样装置，氢火焰化检测器，XS205型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.01 mg)。

1.2 试药 1，8-桉叶素对照品(批号：C004G005，含量99.0%)，樟脑对照品(批号：110747-201409，含量：98.7%)，薄荷脑对照品(批号：110728-200506，含量100.0%)，龙脑对照品(批号：110881-201107，含量：99.3%)，均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量≥98%；萘(湘中地质实验研究所)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)均为分析纯，金喉健喷雾剂样品由贵州宏宇药业提供(批号：141019，141020，141021，141022，141042，141043，141044，141045，141047，141049)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 DB-WAX毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；载气为氮气，流速：12 mL·min-1；氢气40 mL·min-1；空气400 mL·min-1，柱流量1 mL·min-1；进样口温度为220 ℃；火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID)温度240 ℃，分流进样，分流比为10：1；进样量1 μL；程序升温：初始50 ℃，维持10 min，以3 ℃·min-1升至120 ℃，维持5 min；内标法。

2.2 溶液的制备

2.2.1 内标溶液的配制 精密称取萘13.914 4 g，置50 mL量瓶，加无水乙醇稀释至刻度，再精密量取5 mL至25 mL量瓶，用无水乙醇稀释至刻度，制成浓度为2.783 mg·mL-1内标溶液

2.2.2 对照品溶液配制 精密称取1.8-桉叶素17.24 mg，樟脑26.81 mg，薄荷脑124.5 mg，龙脑对照品72.8 mg，置于5 mL量瓶，加无水乙醇溶解并定容，制成浓度分别为1，8-桉叶素3.413 5 mg·mL-1，樟脑5.292 3 mg·mL-1，薄荷脑24.9 mg·mL-1，龙脑14.458 mg·mL-1的单一对照品溶液。

2.2.3 混合对照溶液配制 精密称取1.8-桉叶素11.98 mg，樟脑14.10 mg，薄荷脑28.51 mg，龙脑对照品11.11 mg，置于10 mL量瓶，加无水乙醇溶解并定容，制成浓度分别为1，8-桉叶素1.186 mg·mL-1，樟脑1.392 mg·mL-1，薄荷脑2.85 mg·mL-1，龙脑1.103 mg·mL-1；各精密量取1 mL置于5 mL量瓶中，再精密加入上述内标溶液1 mL配制成浓度为1，8-桉叶素0.237 mg·mL-1，樟脑0.278 mg·mL-1，薄荷脑0.57 mg·mL-1，龙脑0.221 mg·mL-1，萘0.557 mg·mL-1混合标准溶液。

2.2.4 供试品的制备 精密量取金喉健喷雾剂2 mL，精密加入上述内标溶液1 mL置于5 mL量瓶，加无水乙醇至刻度即得。

2.2.5 阴性样品的制备 按处方量制备缺艾纳香油，大果木姜子油，薄荷脑的阴性供试品，再按供试品制备项下制备成阴性样品。

2.3 系统适应性实验 在“2.1“项色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各1 μL，分别注入气相色谱仪中，测定，结果见图1，实验结果表明各色谱峰分离度良好，阴性供试品溶液无干扰。

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.2“项下1，8-桉叶素对照品、樟脑对照品0.05，0.1，0.2，0.4，0.6 mL，薄荷脑、龙脑对照品0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL，分别置于5 mL量瓶中，分别精密加入上述内标溶液1 mL，加无水乙醇至刻度，摇匀，制成标准系列溶液。分别精密吸取系列对照品溶液1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以对照品溶液与内标溶液的浓度比值为横坐标，峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程(表1)。结果表明1，8桉叶素、樟脑、薄荷脑、龙脑在各自相应的浓度范围内均呈出良好的线性关系。

1.1，8-桉叶素；2.樟脑；3.薄荷脑；4.龙脑；5.萘

图1 阴性样品(A)对照品(B)和样品(C)GC色谱图

1.1,8-cineole;2.camphor;3.menthol;4.borneol;5.naphthalene

Fig.1 GC chromatogram of negative sample (A), control (B) and sample (C)

表1 4种成分的回归方程和线性范围

Tab.1 Regression equation and linear range of four ingredients

成分回归方程r线性范围/(mg·mL-1)1,8-桉叶素Y=1.4922X+0.00350.99980.034^0.410樟脑Y=1.439X-0.00030.99970.053^0.635薄荷脑Y=1.4085X+0.00330.99990.996^4.980龙脑Y=1.4587X-0.01390.99990.578^2.892

2.5 仪器精密度 取“2.2.4”项下对照品混合溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算各化合物峰面积与内标峰面积比值的RSD，1，8-桉叶素、樟脑、薄荷脑、龙脑的RSD分别为0.31%，0.12%，0.08%，0.07%，表明仪器精密度结果良好。

2.6 稳定性实验 取同一份供试品溶液，在前述色谱条件下分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定，记录峰面积，计算各化合物峰面积与内标峰面积比值的RSD，1，8-桉叶素，樟脑，薄荷脑，龙脑RSD值分别为0.96%，0.78%，0.77%，0.66%，表明供试品溶液在24 h内能保持稳定。

2.7 重复性实验 取同一批样品6份，分别按供试品制备方法制备供试品溶液，计算各化合物峰面积与内标峰面积比值的RSD，1，8-桉叶素，樟脑，薄荷脑，龙脑RSD分别为1.01%，0.92%，0.95%，0.83%。表明该方法具有较好的重复性。

2.8 加样回收实验 精密量取1 mL已知含量的同一批样品9份，分别按已知质量分数的80%，100%，120% 3个水平加入1，8-桉叶素，樟脑，薄荷脑，龙脑对照品溶液，按“2.2.2”项制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，结果1，8-桉叶素、樟脑、薄荷脑、龙脑平均回收率分别为99.0%，99.0%，102.5%，100.6%，RSD分别为2.42%，0.84%，2.31%，2.91%。见表2。

2.11 校正因子重复性考察

2.11.1 不同色谱柱考察 精密吸取“2.2.3”项下混合对照品溶液(n=4)，在上述色谱条件下分别进样1 μL，在同一台仪器上分别考察DB-WAX毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；Rtx R-WAX毛细管柱(30 m×0.53 mm，1 μm)；Elite-WAX毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)3种不同厂家色谱柱，计算各化合物校正因子。结果DB-WAX，Rtx R-WAX，Elite-WAX的1，8-桉叶素，樟脑，龙脑平均校正因子分别为0.871，0.94，0.95；0.882，0.958，0.951；0.860，0.930，0.974；RSD为1.26%，1.51%，1.42%。

表2 4成分的加样回收率实验结果Tab.2 Recovery results of four ingredients

2.11.2 待测组分色谱峰的定位 精密吸取“2.2.3”项下混合对照品溶液(n=4)，在上述色谱条件下分别进样1 μL，在同一台仪器上考察上述3种色谱柱，利用薄荷脑的相对保留时间，利用待测成分对于薄荷脑保留时间差做为上述待测成分的定位指标，结果DB-WAX，Rtx R-WAX，Elite-WAX 1，8-桉叶素，樟脑，龙脑保留时间差分别为21.82，6.88，2.13；22.95，6.67，2.28，22.91，6.87，2.10；RSD为2.84%，1.77%，4.40%。

2.13 样品测定 取10批金喉健喷雾剂样品，按前述所建立的方法分别测定样品中1，8-桉叶素，樟脑，薄荷脑，龙脑的含量，采用内标法和一测多评法计算不同批次的4个成分的含量，结果见表3。由表3结果表明，本实验所建立的内标法测定与一测多评法的计算结果比较无明显差异，表明一测多评法用于金喉健喷雾剂的多成分质量控制是可行的。

表3 金喉健喷雾剂中4种有效成分含量测定结果

Tab.3 Results of content determination on four ingredients inJinhoujianspray

mg·mL-1，n=2

3 讨论

根据样品的性质，供试品制备方法考察使用水蒸汽蒸馏法和挥发油提取法[11]，结果表明水蒸汽蒸馏法和挥发油提取法提取待测组分有所损失，挥发油提取法提取的供试品溶液和样品直接上样的结果没有太大的区别，从节约样品处理时间方面考虑，最终选择直接使用样品上样。

系统适用性实验中，分别考察不同柱温(40，50，70，80，100 ℃)及不同流速(1，2，1.0，0.8 mL·min-1)色谱分离情况，升温程序考察恒温和程序升温，结果表明恒温目标峰出峰时间太长且薄荷脑与龙脑的峰未得到分离，综合考虑分离度和分析时间等因素，最终选择程序升温，分别考察10 ℃升至180 ℃，5 ℃升至150 ℃，4 ℃升至135 ℃，樟脑，薄荷脑，龙脑都未能与周围杂质峰分离，最终选择柱温50 ℃，保持10 min，2 ℃升至120 ℃升温程序，保持5 min，柱流量1.0 mL·min-1，该色谱条件下4个有效成分均能达到基线分离，满足含量测定的要求。

内标物选择实验中，考察萘、正庚烷、环己酮和水杨酸甲酯等，因样品中目标峰周围杂质峰较多，结果选择萘作为内标，因其出峰时间在目标峰之后，且与待测组分的保留时间相近却能完全分离，且峰周围无干扰。

本实验对目标峰的定位除了目标成分峰形判断外，考察相对保留时间之比和保留时间差来定位，结果考察不同色谱柱的待测组分保留时间差RSD<5%，使用相对保留时间比定位时，1.8-桉叶素峰的相对保留时间RSD>5%，所以最终选择采用保留时间差指认其他3个峰的位置。

选择一测多评内标参照物时因薄荷脑对照品含量较高，价格较便宜且易得，故本实验选用薄荷脑为参照物，由于同时实现4种有效成分的多指标含量测定所用的对照品的量较大，对照品所需费用较高，所以本实验引入一测多评法于金喉健喷雾剂多指标质量评价，实验证明一测多评所得成分含量的计算值与内标法实测值差异无统计学意义，说明一测多评法可以应用于金喉健喷雾剂多指标的含量测定。

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Analysis of Four Effective Components in Jinhoujian Spray by Quantitative Analysis of Multi-components by Single Marker

WANG Liou1, YANG Juanyan3, MAO Xiangjun2, YANG Weiwei1, LUO Yi1

(1.CollegeofPharmacy,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,China；2.GuizhouProvincialFoodandDrugInspectionInstitute,Guiyang550004,China；3.GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002,China)

Objective To establish a methodological study pattern of quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS), and examine its feasibility and technical applicability in the quality control of compound preparation of traditional Chinese medicine-Jinhoujianspray. Methods Gas chromatographic method (GC) was used and naphthalene served as the internal standard.Menthol was used as the reference substance.The relative correlation factors (RCF) of 1,8-Cineole, camphor and borneol to menthol were calculated and established to carry out QAMS.The accuracy of this method was confirmed by comparison of internal standard method. Results The reproducibility of relative correction factor was perfect.The two methods did not show significant difference in 10 bathes of samples. Conclusion The QAMS method is feasible, credible, and can be used to determine active ingredients inJinhoujianspray.

Jinhoujian spray；Quantitative analysis of multi-components with a single-marker；Correlation factors, relative；Content determination

2014-10-15

2015-01-12

*贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(黔科合中药字[2012]5030)；贵阳市科技计划项目(筑科合同[2012204]-1)

王俪瓯(1989-)，女，贵州贵阳人，硕士，主要从事药品质量研究。电话：(0)13985548353，E-mail：1195790708@qq.com。

茅向军(1964-)，男，贵州贵阳人，主任药师，博士，主要从事药品质量研究。电话：(0)13368610577，E-mail：1074459931@qq.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)10-1356-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.025