中卫山羊KAP6.2基因的PCR-SSCP分析

李新海，苑瑞芳，柏 丽，冯登侦

（宁夏大学动物科学系，宁夏 银川 750021）

中卫山羊KAP6.2基因的PCR-SSCP分析

李新海，苑瑞芳，柏 丽，冯登侦⋆

（宁夏大学动物科学系，宁夏 银川 750021）

角蛋白关联蛋白KAP基因家族是毛生长发育的重要基因，其中KAP6.2基因影响山羊的绒毛性状。为研究在中卫山羊群体中其对绒毛的影响，本试验采集187只中卫山羊耳组织样提取DNA，利用PCR-SSCP技术检测KAP6.2基因的SNP多态。试验检测到5种基因型，4个等位基因，其中AA（基因型频率为0.51）为优势基因型，A（等位基因频率为0.61）为优势等位基因。群体多态信息含量为0.45，为中等多态。试验结果显示KAP6.2基因在中卫山羊群体中存在中等多态性，这将为在中卫山羊群体中开展绒毛性状与KAP6.2基因多态性的关联分析提供遗传根据。

中卫山羊；KAP；PCR-SSCP；羊绒；SNP

角蛋白关联蛋白 KAP（Keratin-associated proteins，KAP）是毛发的重要结构蛋白，它们影响着毛发的物理特性[1-3]。KAP6家族是富含甘氨酸/酪氨酸的Ⅱ型角蛋白[4]。SNP多态标记在畜禽遗传育种中应用很广泛[5]。张亚妮等（2007）[6]研究了KAP基因的4个SNP多态位点，发现在产绒量上存在优势等位基因。王杰等（2010）[7]研究发现，KAP6.2的某SNP多态中，AA基因型的绒长度显著高于杂合子和另一基因型；BB基因型的绒细度显著高于杂合子与另一基因型。可见，KAP6.2基因SNP多态与山羊绒性状有相关。中卫山羊是宁夏特有的国家畜禽资源保护品种，以产白色沙毛裘皮为主。由于禁牧的实施，饲养成本增大，且中卫山羊产绒量较低，养殖效益很低，目前中卫山羊饲养量少，处于保种状态[8]。中卫山羊羊绒柔软细长，光泽亮白，绒直径14μm左右，绒长66 mm，含绒量56%，品质优良，但是绒纤维中两型毛较多，绒、毛混生，不易分梳，且中卫山羊产绒量低，平均单产仅有170～200 g[9]。为提高中卫山羊的绒产量，以增加效益减少保种费用，拟通过分子标记辅助选择育种来提高其绒产量。本试验从中卫山羊保种群中选取187只进行KAP6.2基因的SNP多态检测，从而为后期进行KAP6.2基因与中卫山羊绒毛性状的关联研究提供遗传依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 在宁夏中卫山羊选育场采集187只中卫山羊的耳组织，-20℃保存。

1.2 PCR试验方法

1.2.1 DNA提取 利用《分子克隆试验指南》的酚氯仿法提取中卫山羊耳组织DNA。

1.2.2 PCR引物 上海生工生物工程股份有限公司合成[10]。

上游引物：TCAGAAACATCCTCTTGCAG下游引物：TAGGCTAAGACGGTGATG

1.2.3 PCR反应体系 25μL反应体系为：DNA模板1μL，上游与下游引物各1μL，PCR 2× Master Mix混合液（购自北京天根生化科技有限公司，包含酶，dNTP，缓冲液等）12.5μL，双蒸水9.5μL。

1.2.4 PCR扩增程序 95℃预变性5 min，循环（94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸30 s）35个，最后延伸72℃ 10 min。

1.2.5 SSCP过程 PCR产物上样前变性，在8%聚丙烯酰胺凝胶（30%丙烯酰胺13 mL，超纯水30 mL，10×TBE 5mL，10%AP 350μL，TEMED 35μL）中150 v电压电泳4 h，银染显带。

1.3 数据统计分析 利用SAS 8.2软件进行卡方检验；利用中国水产科学研究院黄海水产研究所种质资源与工程育种室发布的多态信息含量计算软件PIC-Calc 0.6进行多态信息含量计算。

2 结果与分析

2.1 DNA提取和PCR结果 使用酚氯仿法提取187只中卫山羊耳组织的DNA，均提取到合乎质量的DNA。

赵苗等（2008）[10]设计的KAP6.2序列上的引物，在内蒙古绒山羊中扩增得到了362 bp的片段。利用相同引物对187只中午山羊的DNA进行PCR扩增，得到了符合目的片段长度，特异性良好的一条PCR带，见图1，可以用于后续SSCP分析。

1～3为3个样品经PCR后的产物条带；DNA marker条带长度由上到下依次为2 000、1 000、750、500、250、100 bp；目的条带长度为362 bp图1 PCR扩增结果Fig.1 Am plification Result of PCR

2.2 SNP分型结果 经聚丙酰胺凝胶电泳，银染显带后，检测中出现的所有基因型如图2所示，共有5种，分别是AA、BB、AB、BC和BD。

图2 SSCP基因型Fig.2 Genotypes of SSCP

从图2中可以看到，共有A、B、C、D 4种基因型，其中A和B下面一条带重合，C与B也有一条带重合，而D的两条带与A、B、C均不重合。理论上存在AA、BB、CC和DD共4种纯合子，6种杂合子，但所测个体中上仅出现2种纯合子与3种杂合子。

2.3 基因型频率和基因频率统计分析 KAP6.2基因在187只中卫山羊中检测到5种基因型、4个等位基因，有AA和BB 2种纯合基因型，AB、BC和BD 3种杂合基因型，统计得到基因型频率和基因频率见表1。

从表1中可以看到基因型以AA、AB、BB三种为主，尤以AA最多，占到所有个体的一半。A、B是优势等位基因，A基因频率最高，为61%。

2.4 多态信息含量计算 见表2。

表1 KAP6.2基因的基因型频率与基因频率Tab le1 Genotype frequency and gene frequency of KAP6.2 gene

表2 KAP6.2基因的多态信息Table2 Polymorphism information of KAP6.2 gene

将等位基因及其频率按格式输入PIC-Calc 0.6的文件中，运行程序，计算得PI=0.45，为中等多态。

3 讨论

3.1 KAP6.2基因的多态位点 内蒙古绒山羊KAP6.2由675个核苷酸组成，59～352共294个核苷酸编码96个氨基酸[11]。试验用引物扩增片段为11～372区段共362 bp的序列，包含了5’端、外显子和3’端[10]。图1结果显示，可得到条带清晰单一的目的片段。图2的SSCP结果显示，试验得到的条带可见，此段序列共4个等位基因，其中A、C、D分别与B组成了3种杂合子。因此，B分别与A、C、D存在SNP差异，但A、C、D之间的SNP不一定是在同一个位点上，这需要进一步的测序验证。

赵苗等（2008）[10]利用相同引物进行的PCR-SSCP分析，结果显示：内蒙古绒山羊中出现了AA、BB、AB型，除去影子带后，与本试验的A、B带型相同，但未出现本试验的C、D等位基因。赵俊星等（2007）[12]扩增序列为73～370区段，共298 bp，包含了外显子和3’端序列，从SSCP图谱看，与本试验图有很大差别，SNP位点与本试验有差别。王杰等（2010）[7]设计藏山羊的SSCP扩增序列为73～359区段，共287 bp，全部在外显子区域，而且只得到两种基因型AA和AB型，其中AA型为优势基因型。由于其片段差异，且SSCP图谱非常不清楚，无法与本试验的等位基因位点进行比较。

3.2 中卫山羊KAP6.2基因杂合度 通过 PCR-SSCP方法对中卫山羊群体KAP6.2基因多态性分析，共检测出5种基因型，其中纯合基因型2种，杂合基因型3种，AA和AB是主要基因型，频率分别为0.51和0.21；群体的多态信息含量、杂合度均处于中等水平，表明中卫山羊群体的KAP6.2基因的选择程度不是很大，没有造成很大的近交纯合。赵俊星等[12]在3个山羊品种中检测的KAP6.2基因多态在0.35～0.38间，赵苗等[10]的多态信息含量为0.17，均低于本试验的0.45。中等程度的多态信息含量有助于进行后续SNP多态与绒毛性状的关联分析。

4 结论

利用一对引物在中卫山羊群体中检测到KAP6.2基因上存在中度程度多态，有4个等位基因，其中A为优势等位基因，这将为后续SNP多态与绒毛性状的关联分析提供依据。

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[4]Fratini A.,Powel l B C,Rogers GE.Sequence, Expression and Evolutionary Conservation of a Gene Encoding a Glycine/Tyrosine-rich Keratinassociated Protein of Hair[J].Biol.Chem, 1993,268∶4511-4518.

[5]霍艳军，陈宠霞，金一.SNPs标记技术及其在牛遗传育种中的应用[J].现代畜牧兽医，2006（6）：57-60.

[6]张亚妮，张恩平，吴迪，等.KAP基因与辽宁绒山羊经济性状的关系研究[J].中国农业科学，2007，40（9）：2062-2067.

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Polymorphism analysis of KAP6.2 gene in Zhongweigoat

Li Xinhai,Yuan Rui fang,Bai Li,Feng Dengzhen*
（Agricultural Col lege,Ningxia University,Ningxia Yinchuan 750021）

KAPs are genes which play impor tant roles in wool development,and KAP6.2 gene affects the goat’s cashmere.In order to study the association between KAP6.2 SNPs and cashmere traits,187 ear tissue samples f rom Zhongwei goats were col lected,and analysis Zhongwei goat KAP6.2 gene polymorphism were determined by PCR-SSCP technology.Five genotypes and four al leles were detected,AA（f requency is 0.51）is the main genotype,A（f requency is 0.61）is the main allele.Polymorphism information content is 0.45,heterozygosity is 0.37 and ef fective al leles is 2.12 in Zhongwei goats.The resul t shows that KAP6.2 gene presents medium polymorphism in Zhongwei goat,which wi l l provide genetic basis for association analysis between KAP6.2 SNPs and cashmere t raits.

Zhongwei goat;KAP;PCR-SSCP;Cashmere;SNP

S826

1672-9692(2015)08-0032-04

2015-6-14

李新海（1979-），男，汉，讲师，博士，主要从事动物遗传育种研究。

冯登侦（1965-），男，汉，教授，硕士，主要从事动物遗传育种研究。

宁夏自然科学基金项目（NZ13035）