稻米中镉快速检测金标试纸条的研制

苏 芳 易翠平

（长沙理工大学化学与生物工程学院，长沙 410114）

稻米中镉快速检测金标试纸条的研制

苏 芳 易翠平

（长沙理工大学化学与生物工程学院，长沙 410114）

制备一种用于快速检测稻米中重金属镉的金标试纸条。将完全抗原Cd-iEDTA-BSA作为T线，羊抗鼠二抗作为C线，包被于硝酸纤维素膜上，纳米金颗粒标记的7E8G9单克隆抗体包被于金标垫上，组装成金标试纸条。试纸条的灵敏度为0.2μg／mL、重复性良好、与Hg2+有较强交叉，最高共存浓度不得高于1.0μg／mL；与 Zn2+有一定交叉，最高共存浓度不得高于 10μg／mL；与 Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Pb2+几乎无交叉；贮存期约为1年。试纸条检测稻米中镉与GFAAS结果一致。成功制备了金标试纸条，并应用于快速检测稻米中重金属镉。

稻米 镉 纳米金 试纸条

镉作为一种蓄积性毒物、易导致人体骨折、高血压、癌症和肾功能紊乱等疾病［1-2］，因此在食品中应及时检出。水稻是对镉吸收最强的谷类作物，其超标率达10.3%［3］，而我国一半以上人口以稻米为主食，因此快速检测其是否超标具有极其重要的意义。常用于稻米中镉的检测方法有原子吸收法、电化学分析法、溶出伏安法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法以及各种方法的联用，但这些设备昂贵、费时费力、需要专门的技术人员，难以进行现场和大规模的检测［4］。为此迫切需要找到一种现场、快速、高效的检测技术。研究报道，胶体金免疫层析技术在黄曲霉毒素［5］、盐酸克伦特罗［6］、三聚氰胺［7］、重金属铬［8］的检测上具有携带方便、操作简单、成本低廉、快速检测、结果肉眼可见等优点，适于对大批量样品进行现场初筛。刘斌等［9］建立了快速检测环境水样中重金属镉残留的胶体金免疫层析法，但目前此类产品在稻米上的应用鲜见报道。

本研究拟在前期研究已制备重金属镉完全抗原Cd-iEDTA-BSA和高亲和力的单克隆抗体［10］的基础上，结合胶体金免疫层析技术，开发一种检测限为0.2 mg／kg［11］定性检测金标试纸条，用于现场、快速检测稻米中重金属镉含量是否超标。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

JY-EQ07胶体金喷墨划线机、JY-EQ01斩切式切膜机：上海杰一生物技术有限公司；DZ400真空包装机：温州市永丰包装机械厂；硝酸纤维素膜（NC膜）、金标垫、样品垫、吸水纸、支持板、铝箔袋、干燥剂、塑料卡盒：Millipore公司；AA6800石墨炉原子吸收分光光度计：岛津公司；Multiskan MK3酶标仪：Thermo公司；96孔酶标板：Corning／Costar公司。

1.1.2 原料和试剂

氯金酸 HAuCl4：Aladdin公司；羊抗鼠 IgG：Sigama；iEDTA：日本同仁化学研究所；牛血清白蛋白（BSA）：瑞士 Roche公司；镉含量为0.106 3、0.210 2、0.428 3 mg／kg的稻米：长沙市质量技术监督局提供；完全抗原 Cd-iEDTA-BSA：前期研究制备［10］；7E8G9单克隆抗体（以下简称单抗，效价1∶256 000，亲和常数 Ka为 2.20×108L／mol）：前期研究制备［10］。

1.2 方法

1.2.1 纳米金溶液的制备

仪器清洗、灭菌及硅烷化处理后，在 Frens［12］的方法上改进：取100 mL 0.01%氯金酸沸腾2 min后加入3.5 mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续加热10 min，至溶液变为酒红色，沸腾8 min，至溶液颜色不再变化时，停止加热，冷却，并用蒸馏水将体积补充至100 mL，4℃棕色瓶避光保存，紫外分光光度计（UV）［13］和透射电子显微镜（TEM）［14］进行鉴定。

1.2.2 金标抗体的制备

1.2.2.1 最佳单抗用量的的确定

采用Mey氏稳定试验［15］：取 5支 1.5 mL的离心管，编号；分别加入1mL pH 8.2［16］的纳米金溶液；分别加入100μL 30、40、50、60、70μg／mL的单抗；各加入100μL 10%NaCl溶液；观察胶体金颜色变化情况，确定颜色未发生变化的最少抗体用量。实际使用时适当增加抗体用量10%～30%，本试验选择增加20%。

1.2.2.2 金标抗体的制备

取1 mL胶体金溶液，用0.1 mol／L K2CO3调节至最佳pH 8.2；边搅拌边逐渐加入最适量的单抗，大约5 min内加完，再继续搅拌30 min；再逐滴加入10%BSA，使其终浓度为1%，继续搅拌20 min；低速离心：将标记好的胶体金溶液在4℃，2 000 r／min条件下离心15 min，小心吸出上清，弃沉淀；高速离心：将上清于4℃，11 000 r／min条件下离心12 min，弃上清；加500μL PBS（含4%PEG-20 000）复溶，再在相同条件下离心洗涤2～3遍；重悬于10倍浓缩PBS（含1.5%BSA和5%蔗糖）中，4℃冰箱过夜。

1.2.3 免疫层析条件的优化

1.2.3.1 T线浓度的确定

选定C线浓度为1.5 mg／mL，分别将Cd-iEDTA-BSA稀释为0.8、1.0、1.2 mg／mL，在 NC膜上划线，与同浓度金标抗体组装成试纸条，添加100μL 0.01 mol／L pH 7.4 PBS进行检测，比较T线随浓度变化试纸条的显色情况和稳定性。

1.2.3.2 C线浓度的确定

选定T线浓度为1.0 mg／mL，分别将羊抗鼠IgG稀释为1.0、1.5、2.0 mg／mL，在 NC膜上划线，与同浓度金标抗体组装成试纸条，添加100μL 0.01 mol／L pH 7.4PBS进行检测，比较C线随浓度变化试纸条的显色情况和稳定性。

1.2.3.3 金标抗体最佳工作浓度的确定

用0.01mol／L pH 7.4 PBS将金标抗体分别进行0.6倍、0.7倍、0.75倍稀释及不稀释；喷于金标垫上，干燥后与 1.0 mg／mL的抗原，1.5 mg／mL的羊抗鼠二抗包被在NC膜上制备试纸条，进行检测，选择显色清晰的最低浓度金标抗体作为以最适金标抗体工作浓度。

1.2.3.4 离子强度对试纸条实际检测的影响

分别用 H2O、0.01 mol／L pH 7.4 PBS、0.02 mol／L pH 7.4PBS（PBS）、0.1 mol／L pH 7.4 PBS（2倍 PBS）作空载和稀释剂进行测定，观察并记录T／C线显色情况，看是否出现扩展和褪色现象。

1.2.4 金标试纸条的组装

将Cd-iEDTA-BSA和羊抗鼠IgG用pH 7.4 PBS分别稀释至最佳工作浓度，以0.8μL／cm的喷量依次间隔5 mm划线至NC膜上，分别作为检测线（T线）和质控线（C线），干燥备用；将金标抗体均匀地点喷在金标垫上，点量为12μL／cm，干燥备用；将样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫依次粘在PVC支撑板上（如图1）；将粘好的支持板材料切成60 mm长、2.84 mm宽的试纸条，并卡在试纸卡中，放入装有干燥剂的铝箔袋中，真空包装好后4℃保存。

图1 金标试纸条的组装示意图

1.2.5 金标试纸条的使用及结果判定

1.2.5.1 金标试纸条的使用

标准检测物的制备：将已知浓度的Cd2+溶液与0.1 mol／L EDTA按体积比9∶1混合，得到螯合物Cd-EDTA；将冷藏的试纸条恢复至室温；加入100 μL待测样本，在室温下静置5 min判定结果。

1.2.5.2 金标试纸条的结果判定

当T／C线颜色深浅相同或T线颜色比C线深时，判定为阴性；当C线颜色明显深于T线时，判定为阳性，且C线颜色越深、T线颜色越浅说明超标越严重；当只有T线显色，C线不显色或T／C均不显色时，判定为无效。

图2 金标试纸条结果判定示意图

1.2.6 金标试纸条的质量评估

1.2.6.1 试纸条的灵敏度

将不同浓度Cd-EDTA标准溶液滴加到进样口，静置5 min，观察T／C线显色情况。

1.2.6.2 试纸条的重复性

将同一浓度Cd-EDTA标准溶液滴加到进样口，静置 5 min，观察 T／C线显色情况，重复6次。

1.2.6.3 试纸条的特异性

将 Hg2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Al3+和Pb2+溶液与0.1 mol／L EDTA按体积比9∶1螯合后，进行浓度梯度稀释，滴加到进样口，静置5 min，观察T／C线显色情况。

1.2.6.4 试纸条的稳定性

将试纸条密封分别保存于37℃和4℃条件下，观察不同温度对试纸条的影响。保存于37℃的试纸条每4 d取出1条分别测定质量浓度为0.2μg／mL Cd-EDTA标准品，保存于4℃的试纸条每周取出1条分别测定质量浓度为0.2μg／mL Cd-EDTA标准品。

1.2.7 试纸条在检测稻米中镉的实际应用

采用镉含量为0.430 0 mg／kg（已用 GFAAS测定）的大米样品进行对比验证试验，具体操作步骤：称取0.3～0.4 g稻米粉碎样品（过60目筛），做10个平行，加一定体积硝酸，微波消解，赶酸至液体剩余体积约50μL；超纯水重复赶酸3～4次；定容至3个不同体积：1）定容至 1 g大米样品／4 mL，经GFAAS测得镉质量浓度为 0.106 3μg／mL；2）定容至1 g大米样品／2 mL，经GFAAS测得镉质量浓度为0.210 2μg／mL；3）定容至 1 g大米样品／mL，经GFAAS测得镉质量浓度为0.428 3μg／mL。NaOH调节pH至7.0，其他同1.2.5.1。

2 结果与分析

2.1 纳米金的制备

目测纳米金溶液呈酒红色，且无漂浮，无沉淀，不浑浊，在日光灯下观察胶体金溶液中无微小颗粒。取一定体积金溶液在200～700 nm范围内进行紫外-可见光扫描。由图3可知，最大吸收峰出现在520.5 nm处，且波峰尖，峰宽窄，说明颗粒均一、分散性好。由透射电镜扫描图可知，金颗粒呈球形、大小均一、分散性良好、无凝聚现象、颗粒平均直径大小为13 nm。

图3 紫外-可见分光光度扫描图

2.2 金标抗体的制备

由于胶体金颗粒表面带有负电荷，当加入的单抗量不足时，胶体金反应不完全，此时再加入一定浓度的NaCl溶液，则会产生盐离子效应，从而改变胶体的性质，最终使金溶液出现由红变蓝的沉聚现象［17］，见表 1。

表1 最佳单抗添加量的确定

因此，当单抗添加量为3.0μg时，由红色变为蓝色，4.0μg时处于红色和蓝色变化中间，5.0、6.0、7.0μg时保持酒红色不变，所以5.0μg为最小稳定量（表1）。本试验合成金标抗体时，在此基础上增加20%的量，即最佳抗体用量为6.0μg单抗／1 mL胶体金溶液。

2.3 免疫层析条件的优化结果

2.3.1 T线浓度的确定

由表2可知，当T线质量浓度为0.6 mg／mL时，显色太弱；当T线浓度为0.8 mg／mL时，显色较弱；当T线质量浓度为1.0 mg／mL时，T／C线显色清晰，颜色相当，容易辨别。故选择T线包被质量浓度为1.0 mg／mL。

表2 T线浓度的确定

2.3.2 C线浓度的确定

由表3可知，当IgG质量浓度为1.0 mg／mL时，T线显色太弱；当IgG质量浓度为1.5 mg／mL时，T／C显色较深，且颜色相当；当IgG质量浓度为2.0mg／mL时，C线显色过深，T线过浅。故选择C线包被质量浓度为1.5mg／mL。

表3 C线浓度的确定

2.3.3 金标抗体最佳工作浓度的确定

金标抗体的稀释程度越高，说明试纸条的灵敏度就越高，但同时显示红色条带越不明显［18］。表4的结果表明，用H2O进行测试时，0.6倍稀释的T线较弱，且有一定扩展；0.7倍稀释的C线成形不够规则；0.75倍稀释度的T／C线显色清晰，线形集中且规则；未做稀释的T／C线显色与0.75倍的差别不大，但是从节约原材料出发，0.75倍稀释的更节约成本，故选择0.75倍稀释度的金标抗体做试纸条。

表4 金标抗体稀释度的确定

2.3.4 离子强度对试纸条实际检测的影响

表5是用H2O、PBS、2倍PBS作空载和稀释剂时金标试纸条的显色情况。结果表明，当离子强度分别为0、0.01、0.02 mol／L时，对空载影响不大，T／C线显色几乎没有差别；但是当用H2O、PBS、2倍PBS分别作稀释剂来稀释Cd-EDTA至目标检测线0.2 μg／mL，可明显看到PBS做稀释剂时，T线几乎消线完全；而H2O做稀释剂和空载时，T线出现扩展和褪色现象，用2倍PBS做稀释剂时，由于离子强度过大，会导致抑制显色。故选择 PBS（0.01 mol／L pH 7.4）做稀释剂，此时离子物质的量浓度为0.01 mol／L（以 Na+计）。

表5 稀释剂离子强度的确定

2.4 金标试纸条的质量评估

2.4.1 试纸条灵敏度

表6的结果表明，0.1μg／mL Cd-EDTA上样时，T／C线显色情况和PBS空载一样；0.2μg／mL Cd-EDTA上样时，T线明显减弱，故灵敏度为0.2μg／mL。

表6 不同浓度Cd-EDTA下试纸条的显色情况

2.4.2 试纸条重复性

滴加0.2μg／mL Cd-EDTA标准溶液至6个试纸条加样孔中，5 min后检测结果。6次重复用0.2 μg／mL Cd-EDTA上样时，T／C线均显色，且颜色深浅一致，说明重复性良好。

2.4.3 试纸条的特异性

通过测定不同浓度梯度的Hg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Al3+、Mg2+和Pb2+与EDTA的螯合物，观察试验结果，得到各种金属离子螯合物的与胶体金试纸条的交叉试验结果，见表7。交叉反应率公式：交叉反应率

表7 各种金属离子螯合物的交叉浓度

由表7可知，当用金标试纸条检测Cd2+时，与Hg2+有较强交叉［19］，最高共存质量浓度不得高于1.0μg／mL；与Zn2+有一定交叉，最高共存浓度不得高于 10μg／mL；与 Cu2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Pb2+几乎无交叉。这说明试纸条测定Cd2+时，最大的干扰离子是 Hg2+，与 Bleke等［19］、张海棠等［20］、唐勇等［21］的研究结果相近。这可能是由于不同金属-螯合剂复合物之间的结构差异很小，容易产生交叉反应。

2.4.4 试纸条的稳定性

将试纸条密封分别保存于37℃和4℃条件下，每到规定时间取出1条测定质量浓度为0.2 μg／mLCd-EDTA标准品。结果表明，4℃条件下贮存4周，试纸条的显色均为阳性，表明稳定性良好；37℃条件下贮存12 d，C线略有褪色迹象，稳定性依然较好。根据试纸条行业的经验，37℃贮存1 d相当于4℃贮存1个月［22］，故判定本试纸条贮存期约为1年。

2.5 试纸条在检测稻米中镉的实际应用

样品液中Cd2+浓度经GFAAS测定后，再用金标试纸条测定结果如表8。

表8 不同浓度大米样液的试纸条测定结果

结果表明，当 Cd2+质量浓度为0.106 3μg／mL时，试纸条T／C线颜色深浅接近，表现为阴性；质量浓度为0.210 2μg／mL时，试纸条T线颜色较深，C线颜色较浅，且几乎消线，表现为阳性；当质量浓度为0.428 3μg／mL时，试纸条T线颜色深，C线完全消线，表现为强阳性。说明试纸条检测稻米中镉与GFAAS结果一致。

3 结论

本研究在前期工作的基础上，以13 nm的胶体金颗粒标记单抗、国家标准中稻米镉的安全警戒线0.2 mg／mL为检测限，制备了一种用于稻米中镉快速检测的定性金标试纸条。该试纸条重复性良好，仅与Hg2+、Zn2+等离子有交叉反应。

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Development of Colloidal Gold-Based Test Strip for the Rapid Detection of Cadmium in Rice

Su Fang Yi Cuiping

（School of Chemical and Biomedical Engineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114）

To prepare a colloidal gold-based test strip for the rapid detection cadmium in rice，synthetic antigen Cd-iEDTA-BSA and goat anti-mouse immunoglobulins were utilized in the test（T）line and control（C）line respectively.They were coated on the nitrocellulose membrane（NC）.Meanwhile，the gold nanoparticles labeled monoclonal antibody 7E8G9 was coated on colloidal gold binding cushion.The results showed that the strip had a high sensitivity of0.2μg／mL，with good repeatability and strong cross reactivity with Hg2+，whose highest concentration of coexistence was not higher than 1.0μg／mL；weak cross reactivity with Zn2+，whose highest concentration of coexistence was not higher than 10.0μg／mL；and almost no cross reactivity with Cu2+，Fe2+，Ca2+，Mg2+，Al3+and Pb2+.The storage period was about1 year，and the detection results of the cadmium in rice by strip was consistentwith GFAAS.The colloidal gold-based test strip for the rapid detection of cadmium in ricewas proved to be prepared successfully.

rice，cadmium，gold nanoparticles，colloidal gold-based test strip

R155.5

A

1003-0174（2015）07-0111-06

国家自然科学青年基金（31301404），湖南省重大专项（2011FJ1002-4）

2014-01-02

苏芳，女，1988年出生，硕士，食品质量与安全

易翠平，女，1973年出生，教授，粮食、油脂与植物蛋白、食品安全与营养