痰热清注射液对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤保护作用的初步研究*

赵中江 邓 哲 孙冀武 刘德红

（广东省深圳市第二人民医院，广东 深圳 518035）

·研究报告·

痰热清注射液对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤保护作用的初步研究*

赵中江 邓 哲 孙冀武 刘德红

（广东省深圳市第二人民医院，广东 深圳 518035）

目的观察痰热清注射液对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤的保护作用。方法选择96只健康SD大鼠随机分为对照组、假手术组、模型组及痰热清组，采用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射法建立SAP大鼠模型，以建模后6、12 h及24 h，分为3个亚组（每组8只）。观察肺损伤指数，分别采用酶联免疫法、半定量逆转录PCR法及蛋白印迹技术检测不同时间点肺组织中RNA及高迁移率族蛋白水平。结果模型组较对照组和假手术在肺损伤指数、细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、白介素-18（IL-18）、骨髓系细胞触发受体（TREM-1）mRNA及高迁移率族蛋白-1（HMGB1）方面差异均有统计学意义（P＜0.01），而痰热清组治疗后较模型组ICAM-1、IL-18、TREM-1 mRNA和HMGB1等水平有降低（P＜0.01），肺损伤指数明显降低（P＜0.01）。结论痰热清注射液能降低重症急性胰腺炎大鼠肺组织中ICAM-1、IL-18、TREM-1 mRNA及高迁移率族蛋白B1水平的表达，有效缓解重症急性胰腺炎大鼠的肺损伤。

痰热清 重症急性胰腺炎 肺损伤 大鼠

重症急性胰腺炎（SAP）病情凶险，有多种并发症，急性肺损伤是最严重的。早期预防和治疗急性肺损伤（ALI）对降低SAP的病死率及改善疾病预后意义重大。痰热清注射液能减轻炎性介质所致的炎症反应，减少多器官功能综合征（MODS）的发生［1］。本实验拟研究痰热清注射液对SAP大鼠肺损伤指数、及不同时间点肺组织中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、白介素-18（IL-18）、骨髓系细胞触发受体（TREM-1）mRNA及高迁移率族蛋白（HMGB1）水平的影响，探讨痰热清注射液对SAP肺损伤的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 96只健康雄性SD大鼠，约2个月龄，体质量150～180g，购自南方医科大学实验动物中心。

1.2 仪器和试剂 仪器DYCP-34A型琼脂糖凝胶电泳仪（购自北京市六一仪器厂）。采用武汉生物制品研究所生产酶联免疫吸附 （ELISA）测定肺组织形中ICAM-1、IL-18水平。采用半定量逆转录PCR法检测肺组织中TREM-1 mRNA。以β-actin作为内参对照。引物由上海生物工程研究所合成。TREM-1的序列为：上游5′TGTGCGTGTTCTTTGTCT 3′，下游5′TGGTAA TAAG2GATGGGAC 3′，产物450 bp；β-actin的序列为：上游5′GGGACCTGACAGACTACCT 3′，下游5′ACAAAGTCCTCAGCCACA 3′，产物854 bp。使用Western blotting法检测肺组织中HMGB1表达，用羊抗HMGBI多克隆抗体（Santa Cruz，浓度1∶400）4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG（深圳晶美，浓度1∶1000）。

1.3 分组与造模 5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射法建立SAP大鼠模型。随机分为对照组、假手术组、模型组及痰热清组，每组24只。将大鼠禁食12 h，自由饮水，称体质量，术野备皮，按1 mL/kg的剂量腹腔内注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉。麻醉成功后固定于手术台，0.5%活力碘消毒，铺无菌单。沿腹白线切开进腹，显露十二指肠，辨认胰胆管及肝门部胆总管，用一小动脉夹阻闭胰胆管近肝门端。在十二指肠内侧可见胰腺呈片状分布，显露清楚胰管，近肠端以小动脉夹夹闭，用24 G头皮针穿刺入胰管，以0.2 mL/min的速度缓慢注入5%牛磺胆酸钠溶液，总量为1.5mL/kg，注毕10min后去除小动脉夹，观察胰腺出现水肿伴出血灶后，说明动物模型已成功建立，退针，按摩穿刺孔1 min，创面封闭胶封闭穿刺孔。将肠管复位，逐层关腹。假手术组大鼠行开腹手术仅翻动肠管，然后关腹。术后禁食，自由饮水。正常对照组麻醉后即取材。各组按模型制备后6，12，24 h分成3个亚组，每组8只。

1.4 标本采集与检测 1）肺损伤指数的测定。大鼠处死后解剖胸腔，剪断两侧肋骨，充分暴露肺叶，自主支气管灌入无菌生理盐水，每次10 mL，共4次，收集灌洗液，以肺泡灌洗液内蛋白含量/血清蛋白含量计算。2）肺组织中ICAM-1、IL-18水平测定。采用酶联免疫吸附（ELISA）测定。3）检测肺组织中TREM-1 mRNA采用半定量逆转录PCR法测定。以β-actin作为内参对照。引物由上海生物工程研究所合成。TREM-1的序列为：上游5′TGTGCGTGTTCTTTGTCT 3′，下游5′TGGTAATAAG 2GATGGGAC 3′，产物450 bp。β-actin的序列为：上游5′GGGACCTGACAGACTACCT 3′，下游5′ACAAAGT CCTCAGCCACA 3′，产物854 bp。反应完成后取RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，结果用凝胶成像系统扫描存盘，通过目的基因与内参对照的积分吸光度比值表示mRNA相对表达量（目的基因相对表达量=目的基因条带密度/β-actin基因条带密度）。4）检测肺组织中HMGB1表达。使用Western blotting法检测。各时相点处死大鼠后，收集完整左肺叶于液氮中保存。取约0.2 g肺组织在冰浴下研碎后取蛋白提取液，12000 r/min离心20min，取中间上清液，再将提取的蛋白等量加样，经10%SDS-PAGE电泳，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。转膜后的硝酸纤维素膜经漂洗后用5%脱脂奶粉阻断非特异性结合，然后用羊抗HMGBI多克隆抗体（Santa Cruz，浓度1∶400）4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG（深圳晶美，浓度1∶1000）37℃孵育1 h，ECL显色，待特异性蛋白带颜色深度达到要求后，终止显色反应。X光胶片压片感光，以图像处理系统对胶片进行扫描，测定各条带的光密度值作定量分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，比较各组大鼠在3个不同时间点检测值的差异，组间比较采用单因素方差分析，两组独立比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组SAP大鼠肺损伤指数比较 见表1。分别于6、12 h及24 h检测肺损伤指数，结果显示对照组和假手术组分别于6、12 h及24 h无明显差异 （P＞0.05），而与模型组差异有统计学意义（P＜0.01），痰热清组与模型组差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组SAP大鼠肺损伤指数比较（±s）

表1 各组SAP大鼠肺损伤指数比较（±s）

与模型组同期比较，*P＜0.01。

组别 n 造模后6 h 造模后1 2 h 造模后2 4 h对照组 2 4假手术组 2 4模型组 2 4 0 . 0 0 6 9 ± 0 . 0 0 2 4*0 . 0 0 6 5 ± 0 . 0 0 1 8*0 . 0 0 7 3 ± 0 . 0 0 3 1*0 . 0 0 7 1 ± 0 . 0 0 1 9*0 . 0 0 6 6 ± 0 . 0 0 2 3*0 . 0 0 6 9 ± 0 . 0 0 3 5*0 . 0 8 3 5 ± 0 . 0 1 2 4 0 . 0 9 3 5 ± 0 . 0 2 2 7 0 . 0 8 0 4 ± 0 . 0 1 2 9痰热清组 2 4 0 . 0 2 5 1 ± 0 . 0 5 2*0 . 0 3 7 9 ± 0 . 0 2 8*0 . 0 3 4 5 ± 0 . 0 3 4*

表2 各组SAP大鼠ICAM-1及IL-18比较（±s）

表2 各组SAP大鼠ICAM-1及IL-18比较（±s）

组 别 时间 I C A M -1（p g / m L） I L -1 8（n g / m L）对照组 造模后6 h 0 . 2 8 ± 0 . 0 3*8 8 . 1 ± 2 3 . 4*（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 2 9 ± 0 . 0 4*8 9 . 8 ± 2 2 . 5*造模后2 4 h 0 . 2 7 ± 0 . 0 6*8 7 . 6 ± 2 6 . 2*假手术组 造模后6 h 0 . 3 1 ± 0 . 0 5*9 3 . 4 ± 3 2 . 2*（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 3 3 ± 0 . 0 3*9 9 . 7 ± 3 8 . 4*造模后2 4 h 0 . 3 6 ± 0 . 0 2*1 2 1 . 4 ± 3 9 . 6*模型组 造模后6 h 0 . 7 5 ± 0 . 2 1 3 7 8 . 8 ± 4 1 . 8（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 8 2 ± 0 . 5 6 5 6 7 . 7 ± 4 6 . 7造模后2 4 h 0 . 9 8 ± 0 . 7 9 7 5 4 . 7 ± 4 2 . 4痰热清组 造模后6 0 . 5 6 ± 0 . 1 8*3 1 2 . 8 ± 4 0 . 8*（n = 2 4） 造模后1 2 h 0 . 7 3 ± 0 . 3 2*4 6 8 . 7 ± 4 3 . 7*造模后2 4 h 0 . 8 5 ± 0 . 1 1*5 8 4 . 7 ± 4 9 . 5*

2.2 各组SAP大鼠炎症介质ICAM-1及IL-18不同时间点水平的比较 见表2。分别于6、12 h及24 h检测各组ICAM-1及IL-18的水平，结果显示对照组、假手术组分别于6、12 h及24 h时间点各组水平相当（P＞0.05），而与模型组差异有统计学意义（P＜0.01），痰热清组较模型组差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 各组SAP大鼠REM-1 mRNA表达比较 见表3。SAP大鼠REM-1 mRNA表达对照组和假手术组各时间点差别无统计学意义（P＞0.05）；模型组6、12、24 h时间点与对照组及假手术组差异有统计学意义（P＜0.01）；而痰热清组与模型组比较在6 h无差异（P＞0.05），12、24 h时间点差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组SAP大鼠肺组织中TREM-1 mRNA表达比较（±s）

表3 各组SAP大鼠肺组织中TREM-1 mRNA表达比较（±s）

组别 n 造模后6 h 造模后1 2 h 造模后2 4 h对照组 2 4假手术组 2 4模型组 2 4 0 . 2 8 ± 0 . 0 4*0 . 2 7 ± 0 . 0 6*0 . 2 9 ± 0 . 0 5*0 . 2 9 ± 0 . 0 4*0 . 2 7 ± 0 . 0 5*0 . 2 9 ± 0 . 0 6*0 . 5 5 ± 0 . 0 9 0 . 6 3 ± 0 . 0 7 0 . 6 9 ± 0 . 0 7痰热清组 2 4 0 . 4 8 ± 0 . 0 5 0 . 5 0 ± 0 . 0 2*0 . 5 1 ± 0 . 0 3*

2.4 痰热清降低SAP大鼠HMGB1表达水平的比较见表4。用Western blotting法检测6、12 h及24 h点各组HMGB1表达水平，结果显示各组在6 h时间点差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组、假手术组分别于12及24 h点与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），痰热清组在12 h及24 h时间点较模型组差异有统计学意义（P＜0.01）。

表4 各组SAP大鼠HMGB1表达比较（±s）

表4 各组SAP大鼠HMGB1表达比较（±s）

组别 n 造模后6 h 造模后1 2 h 造模后2 4 h对照组 2 4假手术组 2 4模型组 2 4 0 . 2 3 ± 0 . 0 3 0 . 2 7 ± 0 . 0 4*0 . 2 3 ± 0 . 0 5*0 . 2 5 ± 0 . 0 4 0 . 2 4 ± 0 . 0 3*0 . 2 6 ± 0 . 0 5*0 . 2 9 ± 0 . 0 3 0 . 5 8 ± 0 . 2 1 0 . 7 3 ± 0 . 1 5痰热清组 2 4 0 . 2 7 ± 0 . 0 9 0 . 4 0 ± 0 . 1 2*0 . 4 2 ± 0 . 1 4*

3 讨 论

SAP病情凶险，病死率高，1周内死亡者多由肺损伤所致。发病早期减少各种肺损伤具有非常突出的意义。SAP时由于众多炎症介质和细胞因子的瀑布样级联反应，从而导致包括肺损伤在内的多器官功能障碍。因此，抗炎疗法成为SAP预防并发症的主要突破口，然而临床采取TNF-α和IL-1β等早期的炎症介质拮抗剂治疗并未取得满意效果，可能存在其他致炎因子介导了内毒素的致死效应。

IL-18不仅使AP病情加重，还可以导致胰外脏器的损伤。Ueda等［2］的研究也发现，急性生理与慢性健康Ⅱ（APACHEⅡ）评分大于7的患者血清IL-18水平明显高于APACHEⅡ评分小于7者。根据Rau等［3］报道，血清IL-18水平在AP早期开始增加，直到观察后期，患者出现胰腺坏死和系统并发症都一直维持着较高的水平。而且那些出现胰腺坏死和系统并发症如肝、肺或肾衰竭等多器官功能衰竭的患者，其血清IL-18水平显著升高。Zhang等［4］在大鼠SAP模型实验中，运用反转录聚合酶链反应技术观察到SAP组大鼠肺组织内的IL-18 mRNA显著增多，而在用转换酶抑制剂的治疗组中大鼠肺内IL-18表达明显减少，推测肺内IL-18产生过多在SAP时ALI过程中起着重要作用。

TREM-1是新近发现的一种有选择性地表达于炎性细胞表面的跨膜受体，隶属免疫球蛋白超家族［5］。实验研究已经证实，TREM-1能够通过跨膜调节蛋白DAP12触发中性粒细胞和单核细胞的炎症反应，诱导炎症因子的分泌和钙离子的动员［6］。Adly等［7］发现升高的sTREM-1可作为新生儿脓毒症早期标志物，反应脓毒症严重程度和预后。Kamei等［8］检测48例AP患者血清sTREM-1浓度，发现AP患者的sTREM-1水平较健康对照组明显增高，且和APACHEⅡ评分呈正相关。本实验中发现，痰热清组TREM-1在12 h及24 h时间点明显低于模型组，说明痰热清注射液可能确实对预后具有明显的作用。

HMGB1是一类广泛存在于真核细胞内的非组蛋白染色体蛋白。杨智勇等［9］发现SAP组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平在建模后迅速升高，约在4～6 h达高峰，之后迅速下降，在建模12 h即降至接近正常水平，一直维持至24和48 h。而HMGB1水平在建模后12 h开始有明显升高，至24和48 h仍维持在较高水平。本实验证实，HMGB1在模型组中随时间而不断增高。但在痰热清组中，其增高幅度明显下降，表明它确实与炎症反应关系密切，同时也说明痰热清注射液能通过降低其浓度起到缓解肺损伤的作用。本研究显示，痰热清注射液确实地降低了肺组织中 ICAM-1、IL-18、TREM-1mRNA及高迁移率族蛋白B1水平的表达，能有效缓解重症急性胰腺炎大鼠的肺损伤。

［1］ 刘德红，邓哲，魏刚，等.痰热清注射液对脓毒症大鼠炎症介质及生存率的影响［J］.中国中医急症，2009，18（7），1127-1129.

［2］ Ueda T，Takeyama Y，Yasuda T，et al.Significant elevation of serum interleukin-18 levels in patients with acute pancreatitis［J］.J Gastroenterol，2006，41（2）：158-165.

［3］ Rau B，Baumgart K，Paszkowski AS，et al.Clinical relevance of caspase-1 activated cytokines in acute pancreatitis：high correlation of serum interleukin-18 with pancreatic necrosis and systemic complications［J］.Crit Care Med，2001，29（8）：1556-1562.

［4］ Zhang XH，Zhu RM，Xu WA，et al.Therapeutic effects of caspase-1 inhibitors on acute lung injury in experimental severe acute pancreatitis［J］.World J Gastroenterol，13（4）：623-627.

［5］ Colonna M.TREMs in the immune system and beyond［J］.Nat Rev Immunol，2003，3（6）：445-453.

［6］ Barati M，Bashar FR，Shahrami R，et al.Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 1 and the diagnosis of sepsis［J］.J Crit Care，2010，25（2）：362-366.

［7］ Adly AA，Ismail EA，Andrawes NG，et al.Circulating soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1（sTREM-1）as diagnostic and prognostic marker in neonatal sepsis［J］. Cytokine，2014，65（2）：184-191.

［8］ Kamei K，Yasuda T，Ueda T，et al.Role of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in experimental severe acute pancreatitis［J］.J Hepatobiliary Pancreat Sci，2010，17（3）：305-312.

［9］ 杨智勇，王春友，熊烱圻.重症急性胰腺炎大鼠血清高迁移率族蛋白-1水平的时相变化及意义［J］.华中科技大学学报：医学版，2004，33（4）：466-468.

The Preliminary Reseach on the Protective Effect of Tanreqing Injection on Pulmonary Injury by Severe Acute Pancreatitis in Rats

ZHAO Zhongjiang，DENG Zhe，SUN Jiwu，et al. The Second People Hosoital of Shenzhen City in Guangdong Province，Guangdong，Shenzhen 518035，China

Objective：To observe the protective effect of Tanreqing Injection on pulmonary injury by severe acute pancreatitis in rats.Methods：96 healthy SD rats were randomly divided into control group，sham operation group，model group and Tanreqing group，5%sodium taurocholate retrograde cholangiopancreatography injection rat model was established by SAP to modeling after 6 h，12 h and 24 h，divided into three sub-groups（n=8）.Indicators of lung injury，and lung tissue ICAM-1，IL-18，TREM-1mRNA were observed and high mobility group protein B1 level was detected by enzyme-linked immunosorbent assay，semi-quantitative RT-PCR and Western blot at different time points respectively.Results：The lung injury index，ICAM-1，IL-18 TREM-1mRNA and HMGB1 of the model group had significant differences from the control group and sham operation group（P＜0.01），but after Tanreqing treatment group compared with the model group，IL-18，TREM-1mRNA and HMGB1 levels were lower（P＜0.01），Pulmonary injury parameters were significantly lower（P＜0.01）.Conclusion：Tanreqing can decrease the expression of the ICAM-1，IL-18，TREM-1mRNA and high mobility group protein B1 in severe acute pancreatitis rats，and effectively alleviate lung injury in rats with the severe acute pancreatitis.

Severe acute pancreatitis；Tanreqing；Pulmonary injury；Rats

R576

A

1004-745X（2015）04-0604-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.04.013

2014-01-10）

广东省深圳市科技计划项目（201202036）