大豆寡糖对体外发酵肠道微生物的影响

周笑犁，孔祥峰*

大豆寡糖对体外发酵肠道微生物的影响

周笑犁1,2，孔祥峰2,3,*

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳550005；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南 长沙410125；3.中国科学院环江喀斯特农业生态试验站香猪研究中心，广西 环江547100）

旨在通过体外发酵技术研究大豆寡糖（soybean oligosaccharides，SBOS）对香猪肠道微生物的影响。无菌采集环江香猪的空肠、回肠和盲肠内容物作为接种物，分别以0（对照 组）、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、8.0%的SBOS和2.0%葡萄糖为底物进行体外发酵。利用末端限制性片段长度多态性技术（terminal restriction fragment length polymorphism，T-R FLP） 分析48 h后发酵液微生物区系，荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）测定发酵液中双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和链球菌的16S rDNA变化。结果表明：SBOS提高了发酵液微生物的多样性；随着SBOS添加量的增大，发酵液中有益菌先增加再减少、而有害菌呈先减少后增加的趋势，其中以2.0%的SBOS添加量发酵效果最优，促进了回肠和盲肠发酵液中双歧杆菌的增殖（P＜0.05）、降低了盲肠发酵液中大肠杆菌和链球菌的增殖（P＜0.05）。

大豆寡糖；体外发酵；肠道微生物

动物胃肠道中复杂而动态平衡的微生物区系对宿主的健康和营养物质的消化吸收起着重要的作用。随动物种类、年龄和日粮等的变化，微生物的种类和数量也有差异[1]。大豆寡糖（soybean oligosaccharides，SBOS）是大豆中或其他豆科作物种子中所含有的可溶性糖类的总称，主要由水苏糖、棉子糖和蔗糖组成，能替代蔗糖应用在功能性食品或低能量食品中[2]。许多研究指出，SBOS具有调节动物胃肠道微生物区系、提高机体免疫功能、降低患病率以及改善生产性能等多种生物学功能[3-4]。笔者的前期研究表明，在日粮中添加0.5%的SBOS可促进香猪肠道对营养物质的吸收，改善机体氨基酸平衡和蛋白质代谢[5]。可见，SBOS对提高机体的营养状况具有重要的现实意义。SBOS是否通过调控肠道微生态来发挥上述有益作用，目前尚未见相关报道。本实验利用体外发酵模型研究不同剂量的SBOS对香猪肠道菌群结构的影响，并利用实时定量聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction，real time-PCR）技术进一步测定了部分细菌数量的变化，旨在为进一步探讨SBOS调控肠道微生物及在肠道中的益生作用提供必要的理论参考。

1 材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

大豆寡糖（SBOS，含量大于85%） 南通四海植物精华有限公司，其中含有水苏糖（≥55%）和棉子糖（≥25%），水分含量低于5%。

细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；5 U/μLLATaq、12 U限制性内切酶HaeⅢ、2×SYBR Green PCR Master Mix日本TaKaRa公司。

7900HT RT-PCR仪、3100毛细管电泳自动序列分析仪 美国ABI公司。

1.2培养液制备

参考Barry等[6]的方法配制培养液。微量培养液组成（g/L）为：NaHCO39.240、Na2HPO4·12H2O 7.125、NaCl 0.470、KCl 0.450、Na2SO40.100、CaCl20.055、MgCl20.047、尿素0.400，加蒸馏水定容至1 000 mL，混匀。痕量缓冲液组成（g/L）为：FeSO4·7H2O 3.68、M n S O4·7 H2O 1.9、Z n S O4·7 H2O 0.4 4 0、CoCl2·6H2O 0.120、CuSO4·5H2O 0.098、Mo7(NH4)6O24·4H2O 0.017 4，加蒸馏水定容至1 000 mL，混匀。使用前在1 L微量培养液中加入10 mL痕量缓液，混匀备用。上述所有试剂均为分析纯，购自国药集团药业股份有限公司。

1.3体外发酵实验

选用正常饲喂的环江香猪，放血处死后，采集空肠、回肠和盲肠的内容物，立即放入事先充有CO2的无菌保温瓶内，混匀。稀释肠道内容物前，37℃水浴条件下向培养液中连续冲入CO230 min，将pH值调整至6.9～7.0。将采集的肠道内容物与培养液混匀（1∶100，m/V），分装于100 mL注射器内，并在注射器中加入一定量的SBOS或葡萄糖。样品处理不得超过30 min，最后将注射器放到摇床上37℃水浴振荡培养48 h[7-9]。

SBOS的添加剂量：设6个添加水平，即分别在培养液中添加0（对照组）、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%和8.0%的SBOS；同时在培养液中添加2.0%葡萄糖的阳性对照。每个处理4个平行，接种物为回肠内容物。确定最适SBOS添加量后，接种物分别为空肠、回肠和盲肠的内容物，每个处理3个平行。

1.4测定指标与方法

1.4.1发酵液微生物DNA提取

发酵结束后，将各组发酵液12 000×g离心20 min取沉淀，并分装至1.5 mL离心管中-70 ℃保存。按细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取发酵液中细菌基因组总DNA，采用微量分光光度计测定DNA浓度，并以OD260nm/OD280nm评价DNA纯度。

1.4.2发酵液微生物末端限制性片段长度多态性技术（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析

PCR扩增l6S rDNA全长，以获得微生物总DNA作为模板。用6-羧基荧光标记的细菌通用引物8F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和1492R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’扩增。50μL的扩增体系中包括2.5 ng DNA模板、5μL10×LA PCR BufferⅡ（Mg2+plus）、8μL2.5 mmol/L dNTP mixture、20μm引物，0.5μL5 U/μLLATaq。PCR反应条件为：预变性95 ℃，5 min；95 ℃ 60 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。取1.0μg扩增反应产物，分别加入12 U限制性内切酶HaeⅢ及相应缓冲液和超纯水，使反应体系为20μL，37 ℃过夜温育。限制性内切酶HaeⅢ对纯化的PCR产物进行酶切的识别位点为：5’…GG|CC…3’…CC|GG…5’。ABI3100毛细管电泳自动序列分析仪分析荧光标记的末端限制性片段（T-RF），此步骤交由上海桑尼生物科技有限公司处理[10-11]。

1.4.3发酵液微生物实时荧光定量聚合酶链式反应（real time-polymerase chain reaction，real time-PCR）分析

采用SYBR GreenⅠ染料法，在real time-PCR仪上扩增不同细菌的16S rDNA序列，并运用Applied Biosystem SDS 2.3进行数据分析。10μL反应体系包括：5μL2×SYBR Green PCR Master Mix，0.2μL染料ROX，0.2μL10μmol/L上、下游引物（表1），2μLDNA模板，ddH2O补充至10μL。PCR反应程序为：95 ℃，30 s；95℃5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。基于总细菌16S rDNA基因相对定量分析样品中的双歧杆菌、乳酸杆菌、链球菌和大肠杆菌，采用2-ΔΔCt法[12]统计目的基因的表达量，即以总细菌为内参，待测细菌表达量以-Δ ΔCt表示。

ΔCt=（Ct目的基因-Ct总细菌）实验组-（Ct目的基因-Ct总细菌）对照组

表1 肠道部分微生物real time-PCR引物参数Table 1 Parameters of primers for several intestinal microbes

1.5数据统计与分析

2 结果与分析

2.1大豆寡糖对发酵液微生物区系的影响

表2 不同添加量大豆寡糖对发酵液中回肠微生物酶切末端限制性片段含量的影响（nn == 44）Table 2 Effect of SBOS concentration on ileum microbial terminal rreesstriction fragments (T-RFs) in fermentation broth (n == 44))

由表2可知，随着SBOS添加量的增加，回肠发酵液微生物区系呈增加趋势，T-RF数分别为25、25、27、28和25，提示过低或过高的SBOS添加量不会增加回肠发酵液微生物的区系。

表3 22..00%大豆寡糖对不同肠段发酵液中微生物酶切末端限制性片段含量的影响（nn == 33）Table 3 Effect of 2.0%SBOS on intestinal microbe T-RFs in fermentation broth (n = 33))

由表3可知，空肠、回肠和盲肠发酵液微生物的T-RF数，葡萄糖组分别为17、19和24，而2.0%SBOS组分别为20、24和28；与葡萄糖组相比，SBOS组在空肠、回肠和盲肠发酵液微生物的T-RF数均增加，说明SBOS提高了发酵液微生物的多样性。

2.2大豆寡糖对发酵液中细菌16S rDNA表达的影响

由表4可知，SBOS组和葡萄糖组发酵液中双歧杆菌16S rDNA表达量均高于对照组；其中双歧杆菌和乳酸杆菌16S rDNA表达量随着SBOS添加量的增加呈先增加后减少的趋势，而大肠杆菌16S rDNA表达量却呈先减少再增加的趋势；当SBOS的添加量为2.0%时，发酵液中双歧杆菌16S rDNA表达量显著高于其他各组（P＜0.05），而大肠杆菌（P＞0.05）和链球菌（P＜0.05）的16S rDNA表达量最低。当SBOS添加量为5.0%SBOS时，发酵液中乳酸杆菌16S rDNA的表达量显著高于其他各组（P＜0.05）。

表5 22..00%大豆寡糖对不同肠段发酵液中微生物16S rDNA相对表达量的影响（n==33）Table 5 Effect of 2.0%SBOS on the relative expression level of16S rDNA in microbes from different intestinal segments infermentation brotthh ((n = 33))

由表5可知，空肠、回肠和盲肠微生物发酵后，其2.0%SBOS组发酵液中细菌的16S rDNA表达量发生了显著变化。与葡萄糖组相比，SBOS组回肠和盲肠发酵液中双歧杆菌16S rDNA表达量显著增加（P＜0.05），盲肠发酵液中大肠杆菌和链球菌16S rDNA表达量显著降低（P＜0.05）。

3 讨 论

在正常生理情况下，猪胃肠道中的主要菌群为乳酸杆菌属、链球菌、拟杆菌属、梭菌属、沙门氏菌、梭杆菌门和真细菌等[13-14]。肠道微生态系统是在一定的生理范围内变动，但肠道微生态平衡一旦被打破，会表现为肠道菌群比例失调和细菌易位，常导致有害菌的大量繁殖，引起腹泻等肠道疾病，严重影响动物健康[13-15]。日粮中的营养成分是影响肠道微生物菌群的组成和机体代谢最主要的因素，肠道微生物和营养物质消化吸收之间的关系密切用[13]。一般认为，发酵底物的化学结构和微生物种类对发酵过程中各种代谢产物的组成和比例具有一定的影响[14]。不可消化的寡糖和多糖等碳水化合物作为微生物的主要发酵底物，可影响微生物发酵产物的种类和数量，目前的研究主要集中在果寡糖、甘露寡糖等，有关SBOS对单胃动物肠道微生物体外发酵研究的相关报道较少。

由于动物实验费时、费力且成本较高，用肠道内容物为接种物进行体外发酵是预测发酵底物营养价值的一种简捷、经济的方法[16]。李万坤等[17]用鸡肠道微生物对多种植物活性多糖进行体外发酵，结果表明多糖和寡糖均能显著改变肠道微生物活性，且多种生物活性多糖显著改变了肠道微生物菌群；张学峰等[4]报道了SBOS对绵羊瘤胃微生物区系影响显著，可提高纤维分解菌的数量，有利于纤维物质在瘤胃内的降解，并且减少了瘤胃内产甲烷菌的数量。本实验通过T-RFLP分析表明，2%SBOS能够提高各肠段发酵液中微生物的多样性，其中以大肠发酵液的微生物区系尤为丰富。这可能是由于大肠中栖居着大量微生物，SBOS被大肠微生物分泌的酶降解或微生物自身酵解后为肠道微生物提供能量，并促进了细菌的大量增殖。这与之前笔者关于发酵液代谢产物的报道一致，即与小肠发酵液相比，SBOS增加了大肠发酵液中短链脂肪酸的浓度、减少了NH3-N浓度[18]，进一步证实了SBOS主要在大肠被微生物降解，提高了微生物区系组成，并以2.0%为SBOS的最适添加剂量。

动物肠道微生物群落结构的建立是一个动态变化过程。如果肠道优势菌属为致病性的厌氧菌（如梭杆菌和梭状芽孢杆菌）和兼性厌氧菌（如大肠杆菌），那么其产生的还原性酶会将尿素转化成氨可能导致直肠癌[19-20]。Lan等[21]报道了SBOS添加到鸡饲料中，可选择性地促进盲肠中乳酸菌的增殖，并抑制了病原菌的增殖；肠道微生物酵解不同底物会产生不同的代谢物，且组成比例也不相同。Gibson等[22]报道，双歧杆菌的增加往往伴随着梭菌属的减少，双歧杆菌对宿主的代谢具有非常有益的作用，可通过黏膜免疫应答、免疫调节等方式影响宿主的健康。本实验通过实时荧光定量PCR分析表明，SBOS具有选择性调节肠道细菌种类与数量的作用，提高了发酵液中双歧杆菌的数量，并抑制了大肠杆菌和链球菌的生长。陈琼等[23]也有类似的报道，即大豆低聚糖可为有益菌的生长提供营养成分，而有益菌数量的增加，降低了肠道环境的pH值，抑制了有害菌的生长。并且在本实验中以2.0%SBOS对双歧杆菌的促生长作用最为明显，而5.0%SBOS对乳酸杆菌的促生长作用最佳。提示SBOS改善肠道微生物群落结构的作用具有剂量效应。

综上所述，SBOS可增加香猪肠道菌群的多样性，有效抑制了大肠杆菌、链球菌等有害菌的繁殖，促进了双歧杆菌等有益菌群的增殖。

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Effects of Soybean Oligosaccharides on Intestinal Microbes in vitro

ZHOU Xiaoli1,2, KONG Xiangfeng2,3,*
(1.Food and Pharmceutical Engineering Institute, Guiyang University, Guiyang 550005, China; 2. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China; 3. Research Center of Mini-Pig, Huanjiang Observation and Research Station for Karst Ecosystems, Chinese Ac ademy of Sciences, Huanjiang 547100, China)

This study was conducted to investigate the effects of soybean oligosaccharides (SBOS) on intestinal microbesin vitro. Jejunum, ileum and cecal digesta collected from Huanjiang mini-pigs were used as the inoculum, and SBOS atdifferent concentrations namely 0, 0.5%, 1.0%, 2.0%, 5.0%and 8.0%, and 2.0%glucose were used as the substrates duringthein vitrofermentation. The slurry was fermented for 48 h in an anaerobicin vitrosystem, and then the intestinal microbeswere determined by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and real time-polymerase chain reaction(RT-PCR) techniques. The results showed that SBOS increased the intestinal microbial diversity when compared with thecontrol group. With increasing addition of SBOS, the beneficial bacteria were increased firstly and then decreased, whilethe bacterial pathogens were suppressed firstly and then enriched; 2.0%of SBOS, the optimal level, increased (P＜ 0.05)Bifidobacteriumin ileum and cecum, but decreased (P＜ 0.05)EscherichiaandStreptococcusin cecum when compared withthe glucose group. These findings suggested that 2.0%SBOS could enrich beneficial intestinal microbes, but suppressedbacterial pathogens in Huanjiang mini-pigs, which could effectively promote the diversity of the intestinal flora.

soybean oligosaccharides; fermentation; intestinal microbes

TS218；R151.3

1002-6630（2015）11-0157-05

10.7506/spkx1002-6630-201511030

2014-06-30

中国科学院“西部之光”人才培养计划重点项目；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAC17B0102）

周笑犁（1985—），女，讲师，博士，主要从事食品营养学研究。E-mail：lizi008009@126.com

*通信作者：孔祥峰（1974—），男，研究员，博士，主要从事单胃动物肠道微生态研究。E-mail：nnkxf@isa.ac.cn