抗坏血酸/半胱氨酸体系美拉德反应形成风味物质动力学

唐乐攀，杨小洪，余爱农,*

抗坏血酸/半胱氨酸体系美拉德反应形成风味物质动力学

唐乐攀1,2，杨小洪2，余爱农1,2,*

（1.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族学院化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000）

在抗坏血酸/半胱氨酸体系中，应用溶剂萃取法对美拉德反应形成的特征风味物质进行富集，通过气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和气相色谱-氢火焰离子化检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）进行定性研究和准确的定量分析，研究其反应动力学。结果表明：基于抗坏血酸的美拉德反应与传统的美拉德反应存在明显差异，主要表现在起始反应温度和风味物质的种类及动力学上。对特征风味物质进行动力学分析发现，2-乙酰基噻吩和3-乙酰基噻吩由于结构相似，含量及动力学表现也极为相似；2-丙基四氢噻吩在高温下浓度会先升高后降低，最终均稳定在0.035 mmol/L左右；2-甲基-4-丙基噻唑和2-乙酰基噻唑含量差别很大，表明两者生成机理完全不同；2-甲基四氢噻吩-3-酮和四氢噻吩-3-酮结构相似，但后者会进一步反应使得两者含量差别较大；甲基吡嗪的生成满足零级动力学，且反应温度高于125 ℃时其生成速率基本保持不变。

美拉德反应；风味物质；动力学

美拉德（Maillard）反应是食品加工和贮藏过程中发生的最主要的非酶褐变反应之一，其实质是羰基化合物和氨基化合物在一定温度下发生的一系列复杂反应的总称[1]。由于该反应可造成食品营养价值的改变，使食品颜色加深，产生特殊的挥发性产物，赋予或改变食品的风味[2]，因此在食品工业中有着特殊的地位。特别是随着人们更加深入地研究，发现使用美拉德反应制备的香料具有香味更加自然浓厚的特点，因此美拉德反应形成风味物质的研究受到广泛重视。

目前对于美拉德反应形成风味物质的研究多集中于产物种类的分析、反应条件的影响和生成机理的研究上[3-7]。但是由于美拉德反应的复杂性，使得反应程度往往难以把握，一般的定性研究并不能对香味物质进行控制和预测，而以定量为基础的动力学研究并不多见。其次，美拉德反应研究体系多以还原糖为主，而抗坏血酸作为一个在美拉德反应中引起广泛注意且具有潜在羰基组分的化合物[8]，广泛存在于植物性食物及动物食品中，但是对其研究却并不多见。就抗坏血酸和半胱氨酸体系而言，Adams等[9]研究了在干燥、烘烤、无溶剂、K2CO3存在等条件下抗坏血酸与半胱氨酸反应形成呋喃类化合物和噻吩类化合物，其他研究工作主要由本课题组完成的，包括pH值、金属离子、尿素以及肌肽等对挥发性物质种类的影响及其形成机理[10-13]，而有关抗坏血酸/半胱氨酸体系美拉德反应动力学研究均未见文献报道。

对美拉德反应进行反应动力学研究，可预测反应速率控制点以及对反应的进程进行最优设计和最优控制。本实验以抗坏血酸和半胱氨酸美拉德体系为基础，使用溶剂萃取法对产生的风味物质进行富集、浓缩，应用气相色谱-氢火焰离子化检测器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）以及气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、标准物质和线性保留指数（linear retention index，LRI）对不同温度条件下风味物质进行定量以及定性分析。选取分离度、峰型较好，LRI之间误差较小，GC-MS相似度较高的特征风味成分作为研究对象。通过GC-FID进行准确定量并找到其含量随温度、时间变化关系，分析其动力学，为今后对于基于抗坏血酸的风味物质生成的控制和预测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-抗坏血酸、L-半胱氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、无水硫酸钠（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司；乙醚（分析纯） 上海嘉定马陆化工厂有限公司；正十三烷、C5～C22正构烷烃美国Sigma-Aldrich公司；四氢噻吩-3-酮、3-乙酰基噻吩、2-乙酰基噻吩 比利时Acros Organics公司；2-甲基-四氢噻吩-3-酮、3-甲基-2-乙酰基噻吩、噻吩（3-2-b）并噻吩 东京Chemical Industry公司；2-乙酰基噻唑、2-甲基吡嗪 中国百灵威化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS 6890N气相色谱-5975I质谱联用仪、1260高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）、6890N气相色谱仪（配有FID检测器） 美国安捷伦科技公司；干浴式氮吹仪 上海安普科学仪器有限公司；BS-124S电子天平 德国赛多利斯公司；P160001厚壁耐压瓶 北京欣维尔玻璃仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：安捷伦HP-5毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25μm）；进样量2μL；进样口温度270 ℃；不分流进样；载气流量0.9 mL/min；程序升温：柱温初始40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min上升至260 ℃，然后以15 ℃/min上升至280 ℃，保持1 min。GC-FID和GC-MS采用同样的色谱条件。

1.3.2 质谱条件

电子轰击离子源；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离电压70 eV；电子倍增电压1 753 V；扫描速率1 scan/s；质量扫描范围30～400 amu。

1.3.3 内标的配制

用微量移液器准确吸取60 μL正十三烷（0.06 mL，45.6 mg，质量浓度为0.76 g/mL）并溶解于20 mL无水乙醚中。此内标相当于2.28 mg/mL的正十三烷乙醚溶液[14]。现配现用。

1.3.4 反应液的制备

[10]，用电子天平准确称取0.880 7 g（0.005 mol）L-抗坏血酸和0.605 8 g（0.005 mol）L-半胱氨酸溶解于50 mL 0.2 mol/L pH 8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，再用适量NaOH调pH值至8并装入P160004厚壁耐压反应瓶中密封。在125、135、140、145、155 ℃条件下分别反应60、90、120、150、180、210 min，反应完成后取出快速冷却。每份样品均反应3 份作为平行样。

1.3.5 风味物质的萃取及浓缩

向50 mL反应液中加入100 μL上述内标溶液（相当于0.228 mg正十三烷），分别用20、20、15、15 mL无水乙醚萃取4 次[15-16]，合并萃取液，并加入适量无水硫酸钠干燥2 h。待干燥完成，倒出萃取液，使用氮吹仪浓缩至约2 mL，转移至气相色谱进样瓶准备进样。

2 结果与分析

2.1 反应温度对产物生成的影响

使用GC-FID对不同温度下反应不同时间形成的挥发物进行分析，图1和图2分别是125 ℃反应60 min和140 ℃反应60 min样品的色谱图。由图1可知，在125 ℃条件下，反应60 min后样品中除了内标物质外，基本上没有检测出其他物质，表明此温度下美拉德反应十分缓慢，几乎没有风味物质产生。这与经典的美拉德反应有着较大的差异，传统的还原糖和氨基酸之间的美拉德反应最高温度一般只有110 ℃，最低在80 ℃下就能够反应[17]，说明基于抗坏血酸的美拉德反应有着特殊的性质，值得进一步深入研究。当反应温度上升至140 ℃后，反应风味物质含量及种类都有明显的增加[10]，大致上，一般食品加工温度在160 ℃以内，否则会损失营养物质，因此本实验选择以140 ℃为中心，研究125～155 ℃条件下温度对风味物质动力学特征的影响。

图1 125 ℃反应60 min风味物质气相色谱图Fig.1 GC chromatogram of volatile flavor compounds formed by Maillard reaction at 125 ℃ for 60 min

图2 140 ℃反应60 min风味物质气相色谱图Fig.2 GC chromatogram of volatile flavor compounds formed by Maillard reaction at 140 ℃ for 60 min

2.2 样品中风味物质的定性分析

表1 风味物质线性保留指数的鉴定Table 1 Identification of volatile favor compounds by LRI

根据实验温度范围，选取具有代表性的125、140、155 ℃，反应时间为120 min的3 组样品，在上述GC-MS条件下进行分析，并通过质谱数据库对各个峰进行初步定性。其次，分别在GC和GC-MS中测定C5～C22正构烷烃，计算各样品中所有物质的LRI取平均值。之后，挑选标准物质分批进行GC分析，并根据C5～C22正构烷烃保留时间计算标准物质的LRI。最后查找相关文献，确定化合物的LRI[12]。表1为相应10 种化合物的LRI。

通过比较色谱图，选取分离度、峰型较好，LRI之间误差较小，GC-MS相似度较高的化合物作为本实验的研究对象。

2.3 风味物质形成的动力学

通过2.2节对化合物的定性分析，根据GC色谱图中各物质与内标物的峰面积比，换算出各化合物的浓度随时间的变化关系。

2.3.1 噻吩类

图3 不同温度条件下2-乙酰基噻吩浓度随时间的变化Fig. 3 2-Acetylthiophene production at a function of reaction time at different temperatures

图4 不同温度条件下3-乙酰基噻吩浓度随时间的变化Fig.4 3-Acetylthiophene production as a function of reaction time atdifferent temperatures

图3、4分别是不同温度条件下2-乙酰基噻吩和3-乙酰基噻吩浓度随时间变化关系。两种物质结构相似，只是取代基的位置不同，故其含量及动力学表现也极为相似。两种物质的含量均随着温度的升高及加热时间的延长而增加，并在155 ℃条件下稳定在0.15 mmol/L左右。当反应温度由145 ℃升高到155 ℃时，60 min时两种物质含量均变化明显，增加了近3 倍。2-乙酰基噻吩由0.034 1 mmol/L升高至0.099 9 mmol/L，3-乙酰基噻吩由0.021 5 mmol/L升高至0.067 4 mmol/L。

考察两种物质浓度随时间的变化关系，发现其变化满足零级动力学方程。分别对其拟合得到相应的表观速率常数（k），见表2。

在低温125 ℃条件下，两种物质的表观速率常数基本相同，这是由于低温条件下两种物质生成都较慢，故差别不大。但是随着温度的升高，2-乙酰基噻吩的表观速率常数增加更快，表明高温更有利于 其生成。

图5为2-丙基四氢噻吩浓度随时间的变化关系，其与上述两种化合物差异较大。当温度达到140 ℃以上时，2-丙基四氢噻吩浓度会先增加至约0.055 mmol/L，之后随着反应时间的增加，浓度会逐渐减小，最终稳定在0.035 mmol/L左右。可能原因是较高温度条件下，2-丙基四氢噻吩会继续发生其他反应而被消耗。

图5 不同温度条件下2-丙基四氢噻吩浓度随时间变化Fig.5 2-Propyltetrahydrothiophene production as a function ofreaction time at different temperatures

2.3.2 噻吩酮类

图6 2-甲基四氢噻吩-3-酮浓度随时间变化Fig.6 2-Methyltetrahydrothiophen-3-one production as a function of reaction time at different temperatures

图7 四氢噻吩-3-酮浓度随时间变化Fig.7 Tetrahydrothiophen-3-one production as a function of reaction time at different temperatures

图8 四氢噻吩-3-酮进一步反应机理[133,,1188]]Fig.8 Proposed formation mechanism of tetrahydrothiophen-3-one[13,18]

2-甲基四氢噻吩-3-酮和四氢噻吩-3-酮的浓度随时间变化的关系分别见图6和图7。虽然两种物质结构类似，但是浓度变化趋势都完全不同，表明其生成机理也完全不同。据文献[13,18]报道，抗坏血酸会按照图8所示的途径发生自身热解反应，之后进一步反应生成噻吩酮类。由图8可知，抗坏血酸分解后生成的四氢噻吩-3-酮会进一步与巯基加成，生成新的化合物，导致其含量比2-甲基四氢噻吩-3-酮低。

图9 2-甲基-4-丙基噻唑浓度随时间的变化Fig.9 2-Methyl-4-propylthiazole production as a function of reaction time at different temperatures

图10 2-乙酰基噻唑浓度随时间的变化Fig.10 2-Acetylthiazole production as a function of reaction time at different temperatures

2.3.3 噻唑类

由图9、10可知，两种噻唑浓度差别很大，2-甲基-4-丙基噻唑浓度最高只有0.02 mmol/L，且温度继续升高，其含量基本保持不变。相同温度条件下，2-乙酰基噻唑的浓度更高，且其浓度随时间变化较明显。当温度从145 ℃升高到155 ℃时，反应60 min后其浓度由0.043 mmol/L升高到了0.073 mmol/L，但之后浓度开始下降，最后稳定在0.06 mmol/L。

2.3.4 吡嗪类

图11 甲基吡嗪浓度随时间的变化Fig.11 Methylpyrazine production as a function of reaction time at different temperatures

由图11可知，反应温度高于125 ℃时，甲基吡嗪的生成浓度显著高于125 ℃时的生成浓度，即使在125 ℃条件下，反应210 min也只有少量甲基吡嗪生成，说明在本实验体系中，只有在135 ℃以上时才能形成具有烧烤风味的甲基吡嗪。

根据实验数据，分别与零、一、二级动力学模型进行拟合，结果发现甲基吡嗪的生成满足零级动力学，与文献[19]报道相一致，并计算得到相应的表观速率常数，见表3。

表3 不同温度下甲基吡嗪的表观速率常数Table 3 Apparent rate constants of methylpyrazine at different temperatures

由表3可知，除了最低温度125 ℃之外，其他所有温度条件下甲基吡嗪的表观速率常数基本相同，表明当温度升高到一定程度时，其生成速率与温度的关系不再明显，与文献[19]报道结果相一致。其原因可能是受反应机理的影响，据相关文献报道[20]，吡嗪类化合物的生成与氨基酸的降解有关，当温度高于125 ℃时，半胱氨酸很快会分解完全，导致吡嗪类化合物前体物迅速积累，故继续升温并不会继续影响其反应速率。

3 结 论

本实验使用溶剂萃取法，通过GC-MS和GC-FID对噻吩、噻唑、吡嗪等特征风味物质进行了定性定量分析。结果发现在低温条件下（125 ℃）基本上没有检测出除了内标物质外的其他物质，说明抗坏血酸/半胱氨酸体系在125 ℃以下美拉德反应缓慢，与传统美拉德反应存在较大差异。

对特征风味物质进行动力学分析发现，不同温度条件下2-乙酰基噻吩和3-乙酰基噻吩浓度随时间变化趋势相近，可能原因是两者结构相似，因此生成机理相同。低温条件下两种物质的表观速率常数基本相同，但是随着温度的升高，2-乙酰基噻吩的生成速率增加更快；较高温度条件下，2-丙基四氢噻吩浓度随着反应时间的延长而增加，但之后逐渐减小，最终稳定在0.035 mmol/L左右；2-甲基四氢噻吩-3-酮和四氢噻吩-3-酮两种物质虽然结构类似，但是含量却差别较大，表明其生成机理完全不同，且四氢噻吩-3-酮会继续参与反应生成新的化合物；两种噻唑类物质2-甲基-4-丙基噻唑和2-乙酰基噻唑浓度随时间变化趋势也不尽相同，表明两种物质的生成机理不同；通过研究甲基吡嗪浓度变化发现，当温度升高到一定程度时，其生成速率保持不变，与文献[19]的报道相一致。

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Kinetic Study of Volatile Favor Compound Formation in Ascorbic Acid-Cysteine Maillard Reaction System

TANG Lepan1,2, YANG Xiaohong2, YU Ainong1,2,*
(1. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Enshi 445000, China; 2. School of Chemistry and Environmental Engineering, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

This study is based on the ascorbic acid-cysteine Maillard reaction system. The volatile favor compounds were enriched by solvent extraction and analyzed qualitatively and quantitatively by GC-MS and GC-FID. The kinetics of their formation was studied. The results indicated that Maillard reaction based on ascorbic acid was quite different from the conventional one. The kinetic changes of 2-acetylthiophene and 3-acetylthiophene were resembled because of their similar structures. At higher temperature, the concentration of 2-propyltetrahydr othiophene increased at fi rst and then decreased to 0.035 mmol/L. The widely varying concentrations of 2-methyl-4-propylthiazole and 2-acetylthiazole were due to different generation mechanisms. Although the molecular structures of 2-methyltetrahydrothiophen-3-one and tetrahydrothiophen-3-one were similar, the latter one could conduct further reaction, thereby leading to a decrease in its concentration. The generation of methylpyrazine was a zero-order reaction and the rate remained the same at a temperature above 125 ℃.

Maillard reaction; volatiles; kinetics

TS201.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201511006

2014-08-11

国家自然科学基金地区科学基金项目（31360408）

唐乐攀（1989—），男，硕士，研究方向为食品化学。E-mail：809328707@qq.com

*通信作者：余爱农（1963—），男，教授，博士，研究方向为食品化学。E-mail：anyufoodchem@hotmail.com