CRISPR/Cas9系统的分子机制及其在人类疾病基因治疗中的应用

璩良，李华善，姜运涵，董春升

苏州大学生物医学研究院，苏州大学医学部，苏州 215123

CRISPR/Cas9系统的分子机制及其在人类疾病基因治疗中的应用

璩良，李华善，姜运涵，董春升

苏州大学生物医学研究院，苏州大学医学部，苏州 215123

CRISPR/Cas系统是广泛存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统，用来抵抗外来病毒或质粒的入侵。近几年，由Ⅱ型CRISPR/Cas适应性免疫系统改造而来的CRISPR/ Cas9基因组编辑技术蓬勃发展，被广泛地应用于生命科学研究的各个领域，并取得了革命性的变化。文章主要综述了 CRISPR/Cas9基因组编辑技术的起源与发展及在生命科学各研究领域的应用，重点介绍了该系统在人类疾病基因治疗方面的最新应用及脱靶效应，以期为相关领域的科研人员提供参考。

CRISPR/Cas9系统；适应性免疫；基因组编辑

基因组编辑技术产生于20世纪80年代，是通过自然状态下同源重组(Homologous recombination, HR)途径对内源性基因进行定点敲除或者替换。由于细胞发生随机同源重组的效率只有百万分之一，且耗时长、成本高，因此限制了基因组编辑技术的广泛应用[1,2]。

21世纪初，科研人员相继开发出锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)技术[3,4]和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN)技术[5～7]，基因组编辑技术得到迅速发展。细胞内有两种DNA损伤修复途径：一种是同源介导修复(Homology directed repair, HDR)，可实现准确的DNA修复，不会产生基因突变；另一种是非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)，会产生DNA序列的突变。2013年初，Science、Nature、Biotechnology和Cell等杂志几乎同时报道了一种不依赖于 FokⅠ核酸酶的基因组编辑技术—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /associated nuclease 9 (CRISPR/Cas9)，该技术是由细菌或古生菌中的 CRISPR/Cas适应性免疫系统发展而来。CRISPR/Cas9核酸酶可以在哺乳动物细胞中进行基因组编辑，实现对靶基因的敲除、突变、插入以及基因抑制和激活等[8～11]。作为一种新的基因组编辑技术，CRISPR/Cas9具有明显的优势：(1)质粒构建容易，只要向载体上插入一段20 bp的能够转录为sgRNA的DNA片段即可。而ZFN和TALEN在构建表达质粒时，需将多个DNA片段连接后再插入载体中，尤其是TALEN载体的构建，通常需要将7～9段1000 bp以上DNA连接后插入目的载体；(2)操作简单，在真核细胞中同时表达 Cas9蛋白和靶向目的基因的单导向RNA (Single-guide RNA，sgRNA)，就可以实现对靶基因DNA的编辑；(3)利用CRISPR/Cas9技术可在大部分的细胞和个体中实现基因组编辑，可同时对多个靶点进行修饰，实验周期短，最快仅需两个月。本文主要综述了CRISPR/Cas9适应性免疫系统的分子机制以及在基因组编辑中的应用，特别是在人类疾病基因治疗中的应用。

1 细菌 CRISPR/Cas9适应性免疫系统的分子机制

1.1 CRISPR/Cas9系统的结构和作用原理

CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古生菌基因组中。CRISPR/Cas系统主要分为TypeⅠ、TypeⅡ、Type Ⅲ 3种不同类型。TypeⅠ是CRISPR系统中Cas蛋白种类最多和最复杂的一种，多种Cas蛋白与成熟的crRNA(CRISPR RNA)一起参与外源DNA的降解[12,13]。Type Ⅲ系统中的Cas蛋白是Cas10蛋白，该系统分为A和B两种类型：A型介导mRNA的降解[14]，B型介导外源DNA 的降解[15]。TypeⅡ系统中只有一种核酸酶—Cas9核酸酶，在该系统中Cas9蛋白与crRNA参与对抗外源噬菌体和质粒的入侵[16,17]。目前，TypeⅡ系统在基因组编辑中应用的最为广泛。如图1所示，CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列组成重复序列的长度通常为 21～48 bp，重复序列之间被26～72 bp 间隔序列(Spacer)隔开[18～20]。CRISPR就是通过这些间隔序列识别外源DNA。Cas系列基因存在于CRISPR位点附近，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9免疫系统依赖 Cas9内切酶家族靶向并切割外源DNA[20]，在这一系统中，crRNA 通过碱基配对与tracrRNA(Trans-activating crRNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合物指导Cas9蛋白在特定的位点切割DNA，其中Cas9的HNH核酸酶结构域切割互补链，其RuvC-like结构域切割非互补链[21]。

近期研究也表明，这样的双链二元复合体RNA可以被sgRNA所替换，Cas9核酸酶能在sgRNA引导下对靶DNA序列进行切割，它与Fok I酶功能类似，但是并不需要形成二聚体就能发挥作用[22,23](图2)。

1.2 CRISPR/Cas9系统应对病毒和质粒入侵的免疫机制

病毒或质粒入侵细菌后，其基因组DNA暴露于细菌胞浆之中，CRISPR重复序列转录、翻译出的Cas复合物对外来DNA进行剪切，产生新的spacer序列。如果产生的新spacer序列能够与CRISPR array内部的短重复序列部分互补，将会通过某种未知的方式整合到细菌基因组的CRISPR array 序列中，从而对该病毒或质粒产生特异性免疫记忆[22～25]。当同类的病毒或者质粒再次入侵该细菌时，被插入的新的spacer序列与短重复序列一起融合转录为crRNA转录的spacer序列可以与病毒或者质粒的DNA进行互补，而与 spacer序列融合的短重复序列可以与tracrRNA部分互补形成 RNA和 RNA复合物，此RNA二元复合物可与 Cas9 核酸酶结合，并引导Cas9核酸酶切割特定互补序列的双链DNA，从而破坏入侵病毒或者质粒的DNA，使其不能在细菌内进行复制。具体机制如图3所示。

图1 CRISPR/Cas的结构

图2 CRISPR/Cas9作用原理

图3 CRISPR/Cas9系统应对病毒和质粒入侵的免疫机制

2 CRISPR/Cas9系统的应用

研究证明Ⅱ型CRISPR/Cas9系统只需利用Cas9核酸酶与sgRNA协同作用就可以完成对入侵DNA的切割[26]。目前，全世界多个科研团队相继证明了CRISPR/Cas9核酸酶可以在线虫(Caenorhabditis elegans)、斑马鱼(Danio rerio)、果蝇(Drosophila melanogaster)、细菌和酵母等模式生物细胞内进行基因组编辑。sgRNA引导Cas9核酸酶在特定的DNA序列进行切割产生双链末端断裂，细胞可以通过HDR或 NHEJ两种途径进行修复，当细胞通过NHEJ途径进行修复时，在连接处有碱基的缺失与插入，会产生开放阅读框的移码突变使靶基因失活，实现基因敲除[27,28]。CRISPR/Cas9技术作为生命科学领域研究技术手段的一个革命性的突破，在构建基因敲除小鼠、遗传性疾病研究、抗病毒研究、癌症研究、功能基因筛选、转录调控研究、单分子标记研究和基因治疗研究等领域中有着广泛应用。

2.1 CRISPR/Cas9系统在基因编辑上的应用

CRISPR/Cas9作为最新的基因组编辑技术，最直接的应用就是对靶基因进行精确的编辑。靶向目的基因的sgRNA和Cas9核酸酶在真核细胞内共表达，sgRNA可以引导Cas9核酸酶识别靶基因序列并进行切割产生双链末端断裂 DNA，引发胞内 HDR或者NHEJ DNA修复途径。当细胞内转有目的基因同源臂的外源DNA时，可以通过HDR途径实现外源基因的敲入[27～31]。最近，中国医学科学院张连峰教授利用CRISPR/Cas9系统成功地将EGFP基因敲入TRDMT1基因座位上[32]。袁晶等[33]运用Cas9基因组编辑技术，对疟原虫(Plasmodium)的基因组实行了基因删除、基因敲入和核苷酸替换。该研究将Cas9质粒、sgRNA质粒与含有同源臂的donor质粒通过电穿孔的方法转到疟原虫的细胞核中，成功地实现了对1.7 kb、4.0 kb和 5.0 kb大小的基因删除，发现同源臂越长，基因删除的效率越高。此外，他们运用类似的方法成功在疟原虫PYO3652基因上融合了myc标签和gfp标记。用此方法可以便于后续的免疫印迹和免疫荧光等实验操作，而不需要购买一些昂贵的抗体或耗费大量的时间制备抗体。荧光标记(如GFP, mCherry等)的引入为观察体内细胞显微条件下蛋白的表达与定位提供了极大的便利。

2.2 CRISPR/Cas9系统在基因治疗遗传性疾病方面的应用

CRISPR/Cas9技术在基因治疗遗传性疾病方面也有着广泛的应用前景。人类基因组中约有25 000个基因，其中大约3000个基因的突变与人类疾病相关，如血友病、苯丙酮尿症、囊性纤维病等。CRISPR/Cas9技术可以使基因组中突变的基因失活或者纠正突变的基因，因此可以从根本上治愈这些基因突变导致的遗传性疾病。2014年，Nature Biotechnology、Science 杂志相继报道了运用CRISPR/Cas9技术治疗FAH基因突变的酪氨酸血症[31]和杜氏肌营养不良疾病[34]。同年8月5日，Xie 等[35]报道了通过该技术治疗地中海贫血症，该研究者将地中海贫血症患者的皮肤细胞诱导分化为诱导性多功能干细胞(Inducible pluripotent stem cell，iPSC )，随后利用CRISPR/Cas9技术修复HBB基因，并将基因修复后的iPSC诱导分化成红细胞，该红细胞能够稳定表达正常的HBB蛋白。该研究利用了piggyBac转座子，因此细胞基因组中没有插入基因编辑操作所带的筛选标记。此研究不仅为治疗人类地中海贫血症提供了很好的思路，也为以后干细胞的基因治疗提供了一种全新的借鉴方法。2013年，李劲松课题组以小鼠为模型，利用CRISPR/Cas9技术纠正白内障模型小鼠受精卵中的 Crygc基因，发现由该处理组受精卵发育而来的小鼠的白内障症状较对照组有了显著地改善[36]。

2.3 CRISPR/Cas9系统在基因治疗病毒感染性疾病方面的应用

CRISPR/Cas9技术在治疗病毒感染性疾病中也有着良好的应用前景。2013年 11月 14日，Virus杂志上的一篇综述对CRISPR/Cas9技术用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染进行了展望[37]，指出可以将HIV感染者的骨髓干细胞分离出来，运用Cas9基因组编辑技术在体外将HIV-1的宿主细胞辅助受体CCR5或CXCR4基因失活，再将CCR5或CXCR4基因失活的 CD34+造血干细胞回输给该患者，这些经过基因编辑的骨髓干细胞可以分化为产生抵抗HIV-1感染的CD4+T细胞。另外，Kamel Khalili研究小组采取直接靶向HIV-1基因组DNA的治疗策略利用CRISPR/Cas9构建靶向HIV-1的LTR U3区的sgRNA[38]，该sgRNA可以引导Cas9核酸酶识别已经整合到HIV-1感染者细胞基因组上的病毒前基因组DNA，并在5′LTR U3区和3′LTR U3区进行切割，从而可以从感染者的基因组上切除已经整合的病毒前基因组DNA，因而可以抑制HIV-1在体内的复制，但是HIV-1前基因组DNA在感染者CD4+T细胞中拷贝数较多，Cas9核酸酶是否能将CD4+T细胞中整合的病毒前基因组拷贝都切除还有待进一步验证。

慢性乙型肝炎由人类乙型肝炎病毒(HBV)感染导致，是肝硬化和肝癌的主要诱因之一。HBV的共价闭合环状 DNA(cccDNA)对于病毒的持续性感染起了主要作用。因此，清除被感染肝细胞内的HBV cccDNA是临床上彻底治愈慢性乙型肝炎的关键。多项研究表明，CRISPR/Cas9技术可以特异性地靶向HBV cccDNA，从而有效抑制HBV的复制[39～43]Seeger等[42]采用了稳定表达 HBV受体 NTCP的HepG2细胞系，然后用HBV去感染该细胞并转染表达Cas9蛋白和靶向HBV cccDNA的sgRNA，证实Cas9核酸酶的确可以靶向切割 HBV 的基因组cccDNA，并使其通过NHEJ途径进行修复，引起核苷酸的缺失或插入，从而抑制 HBV 在肝细胞内的复制。我们实验室也成功构建了靶向HBV基因组的 Cas9质粒并证明在细胞和小鼠体内能有效清除HBV cccDNA，抑制病毒复制[39]。此外，Suenaga等[44]运用 CRISPR/Cas9技术对单纯疱疹病毒(HSV)基因组进行基因组编辑，成功实现了对HSV基因组进行基因敲除与敲入，这些突变后的HSV可以应用于癌症治疗，该研究为其他DNA病毒如EB病毒、巨细胞病毒等的基因组学研究提供了一种新的思路。

2.4 CRISPR/Cas9系统在癌症方面的应用

2014年，Torres等[45]首次报道了应用CRISPR/Cas9技术构建癌症模型的研究，在该研究中Cas9在特异性sgRNA的引导下，在染色体特定位点DNA处进行切割，使被切割的染色体发生倒位和异位，准确模拟了人类一些肿瘤例如急性髓系白血病和尤文氏肉瘤的形成过程。同年，Xue等[46]运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功地将抑癌基因p53和pten进行双突变，构建了肝癌动物模型。Platt等[47]报道了小鼠肿瘤模型，将器官靶向的各种亚型的AAV载体作为CRISPR/Cas9的递送系统，在肝、脑、肺等器官中实现Cas9核酶的特异性表达，并且成功构建了肺腺癌小鼠模型。由此可见，AAV载体与CRISPR/Cas9技术的联合运用将会在癌症的个体化治疗中发挥越来越重要的作用。

2.5 CRISPR/Cas9系统在高通量筛选和功能基因组学上的应用

近来，基于CRISPR/Cas9系统慢病毒介导的功能基因筛选文库在高通量筛选和功能基因组学的应用取得了很大进展。2014年1月，Shalem等[48]成功构建了由慢病毒介导的靶向 18 080个基因的CRISPR-Cas9 knockout(GeCKO)文库。他们首先运用GeCKO文库验证了肿瘤细胞或多能干细胞生存相关的几个已知基因，然后又以黑色素瘤为模型，通过该文库成功筛选了在黑色素瘤发生过程中几个关键基因，如NF2、CUL3、TADA2B和TADA1。与此同时，Wang等[49]也成功地构建了基于CRISPR/Cas9系统的慢病毒sgRNA基因筛选文库，并通过此文库证实了DNA错配修复过程中的所有关键基因，而且还发现了抗肿瘤药 etoposide作用的两个靶基因TOP2A和 CDK6。北京大学魏文胜教授课题组也报道了基于CRISPR/Cas9系统的慢病毒sgRNA细胞文库[50]，并且建立了功能基因筛选平台以及通过高通量测序技术分析数据的一整套技术路线。他们利用这一基因筛选技术，成功鉴定出白喉毒素和炭疽毒素的细胞表面受体，为研究病原菌与宿主相互作用和信号通路提供了极大的便利。

2.6 CRISPR/Cas9系统在研究基因表达调控方面的应用

sgRNA可以引导 Cas9核酸酶识别并切割靶DNA序列，对 Cas9蛋白中具有核酸酶活性的结构域进行突变得到无核酸酶活性的Cas9 (dCas9)，再将其与一个转录抑制或者转录激活调节的结构域融合表达，表达的融合蛋白在sgRNA的引导下靶向识别目的基因启动子区域，融合表达的转录激活结构域或转录调节结构域会招募相关的转录因子，从而准确特异地调控靶基因的表达(图4)。已有报道表明利用此原理建立 CRISPR-ON系统[51]，转录激活结构域显著地激活了IL1RN、SOX2和OCT4报告基因的表达。Qi等[52,53]利用类似的方法在人类细胞和酵母细胞中成功实现了对基因的激活或抑制。在该研究中，他们将这种Cas9介导的抑制细胞内基因表达的方法称为CRISPRi。CRISPRi有以下优势：(1)针对不同的目的基因，只需设计一个 sgRNA即可；(2)可以在同一个细胞中设计多个针对不同基因启动子的sgRNA，同时研究多个基因的表达、激活或抑制；(3)RNAi作用于翻译阶段，而CRISPR作用于转录阶段，因此 CRISPR调控基因表达的效率会高很多，作用会更明显。

2.7 CRISPR/Cas9系统在活细胞单分子标记领域中的应用

活细胞单分子标记技术是研究细胞内单个分子构象变化和动力学的一门前沿技术。2013年，Chen 等[54]将 Cas9核酸酶中具有核酸酶活性的结构域进行突变，使其丧失核酸酶活性，再将失去核酸酶活性的dCas9蛋白与绿色荧光蛋白EGFP融合；在活细胞内，靶向染色体端粒重复序列的 sgRNA将dCas9-EGFP引导到端粒区域，使得染色体末端端粒区域发出荧光，借此可以清晰观察活细胞内端粒的延伸与缩短；在此基础上，他们设计了靶向单拷贝基因MUC4的sgRNA，成功观察到绿色荧光蛋白基因标记的MUC4基因。由此可见，CRISPR/Cas9系统与单分子标记技术的有效结合，可为研究活细胞内染色体和基因的构象和动力学提供一种强大工具。

图4 Cas9系统调控基因表达的作用机制

3 CRISPR/Cas9系统的发展与展望

CRISPR/Cas9系统是靶向基因编辑的一项利器，在构建基因敲除细胞系和基因敲除动物模型、基因治疗遗传疾病和感染性疾病等研究领域有良好的应用前景，但是该技术也存在着一定弊端如脱靶效应，这也是基因治疗应用中急需解决的问题之一。脱靶效应会导致基因组中其他序列突变、癌基因激活等不良后果，给临床应用带来风险。Duan等[55]通过深度测序分析靶向emx1基因的sgRNA结合位点发现，除了OT2-1 和OT2-4两个位点外，大部分脱靶效应位点虽然含有与靶向RNA互补的10～12 bp的种子序列和3 bp的PAM序列(NGG)，但Cas9并不切割这些脱靶位点。研究人员还发现Cas9核酸酶的脱靶效应具有细胞特异性，他们猜想染色质构象和其他的表观遗传因素参与此调控。2013年9月，张锋课题组通过将Cas9蛋白的核酸酶结构域突变，使得突变的dCas9蛋白只能对靶向DNA的一条链进行切割。这样对于某个基因 DNA双链的切割可以通过设计两条不同识别序列的sgRNA完成，该策略可使脱靶效应降低1000倍[30]。 随后，Tsai等[56]和Guilinger 等[57]各自报道了融合蛋白 dCas9-FokⅠ可有效降低CRISPR的脱靶效应。研究人员通过构建表达dCas9-FokⅠ，两个sgRNA分别引导dCas9-FokⅠ结合到相距15～20 bp的靶DNA区域，FokⅠ实现二聚化而被激活，对中间的DNA序列进行切割，产生双链末端断裂。

如何有效地将 Cas9基因组编辑质粒准确地靶向运输到特定的细胞、组织和器官中，实现精确导向的的基因治疗[58～62]，也是当今基因治疗领域的一大难题。在体外对一些细胞进行基因组编辑，可以用电穿孔或病毒载体将 Cas9基因组编辑质粒转入细胞之中。电穿孔的方法进行基因转染对细胞的损伤较大，这些细胞在体外经过电穿孔处理后，细胞的活力可能会降低，回输到体内后达不到理想的效果。病毒载体如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体等在体外应用比较广泛[63～65]。利用慢病毒载体可以使细胞稳定、持续表达 Cas9核酸酶和sgRNA，从而取得较高的基因敲除效率，但也会相对地增加 Cas9核酸酶的脱靶效应；值得注意的是，慢病毒载体在细胞基因组中随机整合，可能会激活癌基因的表达，在应用于基因治疗时不容忽视。在体内基因递送和基因治疗应用中，腺相关病毒AAV载体应用十分广泛。Platt等[47]将CRISPR/Cas9基因编辑系统与AAV系统相结合，成功地对小鼠脑细胞进行了基因编辑，还构建了肺腺癌小鼠模型。也有报道利用AAV递送Cas9基因编辑系统，成功地对小鼠脑部神经细胞的多个基因进行编辑，观察到了小鼠行为上的变化[66]。除了AAV载体外，纳米颗粒和脂质体也是一种充满前景的递送工具[67,68]。纳米颗粒或脂质体可以包裹按一定比例配制的表达Cas9核酸酶的mRNA和sgRNA, 作为药物被摄入体内。这可以更好地控制服用剂量，并且也极大的降低了机体对于外来刺激的免疫反应。

综上所述，CRISPR/Cas9基因组编辑技术是生命科学领域一项重要的发现与创造，在生命科学研究的领域具有广泛应用，随着CRISPR/Cas9系统的发展，其在人类疾病基因治疗中必将具有光明的应用前景。

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(责任编委: 谢建平)

The molecular mechanism of CRISPR/Cas9 system and its application in gene therapy of human diseases

Liang Qu, Huashan Li, Yunhan Jiang, Chunsheng Dong
Institutes of Biology and Medical Sciences (IBMS ), School of Medicine, Soochow University, Suzhou 215123, China

CRISPR/Cas system is an adaptive immune system that confers resistance to exogenous virus or plasmid in bacteria and archaea. In recent years, the booming CRISPR/Cas9 genome editing technology modified from typeⅡCRISPR/Cas adaptive immune system has been widely applied to various research fields of life science and led to revolutionary changes. In this review, we summarize the origin and development of CRISPR/Cas9 genome editing technology as well as its applications in life science research. We focus on the latest application of this system in gene therapy of human diseases and the associated side/off-target effects, which may provide references for researchers in related areas.

CRISPR/Cas9 system; adaptive immune system; genome editing

2015-03-16;

2015-07-23

国家自然科学基金项目(编号：K113415011)，江苏省大学生创新创业训练计划项目(编号：201310285046Z)和苏州市科技局项目(编号：SYS201452)资助

璩良，本科生，专业方向：生物技术(免疫工程)。E-mail: quliangsuda@163.com

董春升，副教授，研究方向：免疫学。 E-mail：chunshengdong@suda.edu.cn

10.16288/j.yczz.15-109

时间:2015-8-4 9:37:07

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150804.0937.004.html