进展期寻常型银屑病患者皮损中IL-22的表达

张晓岚1，陈洋，姜奕

（1.辽宁医学院附属第一医院皮肤科，辽宁 锦州 121000；2.中国医科大学附属第一医院皮肤科，沈阳 110001）

进展期寻常型银屑病患者皮损中IL-22的表达

The Expression ofIL-22 in Skin Lesionsof Patientswith Advanced Psoriasis Vulgaris

张晓岚1，陈洋2，姜奕2

（1.辽宁医学院附属第一医院皮肤科，辽宁 锦州 121000；2.中国医科大学附属第一医院皮肤科，沈阳 110001）

通过应用实时定量PCR以及免疫荧光检测方法对31例进展期寻常型银屑病患者的皮损冰冻标本进行检测，分析其皮损中的IL-22的表达。结果发现，进展期寻常型银屑病患者皮损IL-22mRNA的表达与正常对照组比较明显增高（P＜0.05）。因此认为，IL-22在进展期寻常型银屑病患者的皮损中呈高表达，进而说明其与寻常型银屑病的发病密切相关。

IL-22；寻常型银屑病

寻常型银屑病是一种常见的慢性复发性的炎症性皮肤病，发病率在北方患者中较高［1］，对于发病机制的研究众多，确切机制尚不清楚，近年来有部分国外学者通过大量研究发现Th17细胞在银屑病发病中起到一定的作用［2］，而IL-22是Th17细胞分泌的重要细胞因子［3］。因此本研究通过应用实时定量PCR以及免疫荧光检测方法对31例进展期寻常型银屑病患者的皮损冰冻标本进行检测，分析皮损中IL-22的表达，进而揭示IL-22与寻常型银屑病发病机制的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

31例进展期寻常型银屑病患者皮损取自于中国医科大学附属第一医院皮肤科门诊及病房，通过两名以上副主任医师进行确诊为进展期寻常型银屑病。取材前均未应用维A酸、环孢素等药物治疗；男20例，女11例，年龄27～88岁［（63.5±17.9）岁］。16例正常对照组皮肤组织标本均取自于中国医科大学附属第一医院皮肤外科患者正常皮损，男9例，女7例；年龄49～78岁［（63.7±8.7）岁］。

1.2 实验方法

1.2.1 设备及材料：低温恒冷切片机（德国leica-CM1900型）；CCD图像采集相机；Olmpus光学显微镜（CH，日本）；电热恒温水箱（tdw-2002型，河北黄骅航天仪器厂）；-70℃深低温冰箱（日本Sanyo公司）；实时定量PCR仪（日本TaKaRaTP800型）。鼠抗人IL-22单抗（美国R＆D公司）；驴抗鼠IgG的荧光二抗（美国R＆D公司）；IL-22 Real-time PCR引物、β-actin Real-time PCR引物（上海生工）。

1.2.2 实验引物设计：利用http：//www.ncbi.nlm.nih. gov网站查取了IL-22基因mRNA的序列，通过序列比对后得到相应的基因组序列，从而应用Primer 5.0软件设计IL-22基因外显子区的实时定量PCR所需的引物，并经过上海生工公司进行合成，其序列如下：IL-22上游引物序列为：ACAACACAGACGTTCGTCTCATTG；IL-22下游引物序列为：GAACAGCACTTCTTCAAGGGTGA；β-actin作为内参照基因，上游引物为TGGCACCCAGCACAATGAA，下游引物为CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA。

1.2.3 实时荧光定量PCR：（1）提取总RNA：利用TRIZOL溶液和氯仿提取总RNA，并利用紫外分光光度计测量其纯度及浓度，保存于-80℃，将RNA用TaKaRa试剂盒反转录为cDNA。（2）实时定量PCR步骤：按照试剂盒进行RT反应：25 μL反应体系的配制：SYBR Prime Ex Taq（2×）12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）1μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2.0 μL。IL-22的反应条件为：预变性，95℃30 s，1个循环；PCR反应：变性，95℃5 s，退火，60℃30 s，共40个循环。IL-22的基因表达的相对变化用△△Ct法处理数据。

1.2.3 免疫荧光检测：OCT包埋标本，在冰冻切片机内常规切片（5 μm），用丙酮固定。标本切片滴加PBS液于已知抗原标本片，10 min后，滴加PBS适当稀释过的一抗，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖湿盒内，在37℃保温1 h。取出玻片，用PBS溶液反复冲洗2次，然后按顺序过PBS三缸浸泡，每缸需5 min，不时振荡。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴稀释后的荧光标记的二抗。在37℃内保温1 min。取出玻片，用PBS冲洗2次，然后按照一定顺序过PBS三缸浸泡，每缸5 min，不时振荡。取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加1滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。

1.2.4 实验结果的判定：在荧光显微镜高倍视野下观察，观察其标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）为无荧光；（±）荧光极弱的，视为可疑荧光；（+）为荧光较弱的，但清楚可见；（++）为荧光明亮；（+++～++++）为荧光闪亮。所取的标本的强度分级在200倍的放大倍数下，由同一个实验者进行操作完成质量控制。

1.3 统计学处理

数据运用SPSS 13.0软件进行统计，计量资料分析符合正态分布，用x±s表示，两样本均数间比较利用t检验（方差齐时）以及校正t检验（方差不齐时）。计数资料采用χ2检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光实时定量PCR的结果

进展期北方寻常型银屑病患者与正常对照组相比较，患者皮损中IL-22 mRNA的相对表达量（13.80±3.41）明显高于正常对照组（9.26±1.96），差异有统计学意义（t=-5.636，P=0.005），见图1。

图1 寻常型银屑病IL-22的溶解曲线

2.2 免疫荧光实验结果

免疫荧光法可见，在进展期寻常型银屑病皮损中IL-22高表达在表皮的角质形成细胞内（图2），正常对照组皮损则不表达IL-22（图3）。与正常对照组皮损相比较，寻常型银屑病皮损中IL-22的表达明显升高（χ2=10.44，P＜0.05），见表2。

表2 进展期寻常型银屑病皮损和正常皮肤中IL-22表达的比较

图2 在银屑病表皮中角质形成细胞内IL-22呈荧光强阳性表达 × 200

图3 正常对照表皮中IL-22呈荧光阴性表达 ×200

3 讨论

银屑病是一种以鳞屑性红斑为主要临床表现的常见复发性慢性炎症性皮肤病，按临床表现分型为4型，其中寻常型银屑病最常见，通常认为发病与多基因的遗传、细菌或病毒感染、免疫、内分泌、神经及精神因素等多重方面有关，其中免疫学研究为近年来的热点。传统学说中认为Th1细胞在其发病中起到重要的作用。而近年来Th17细胞的发现让国内外学者对其与寻常型银屑病的发病之间的联系进行了更多的研究。

IL-22是2000年Renauld等［4］发现，作为IL-10细胞因子家族中的一员，也是TH17细胞中的一个重要的效应分子，由179个氨基酸残基相组合［5］，参与人体的免疫功能，与多种免疫性疾病发病有关［6，7］。近年来国外学者通过对IL-22在寻常型银屑病患者发病中所起作用的相关研究中发现：（1）IL-22通过激活角质形成细胞，从而降低了促角质形成细胞分化的相关因子（如角蛋白1、角蛋白10、丝聚合蛋白原、激肽缓解酶7等）的表达，进而抑制了角质形成细胞的终末分化［8，9］。（2）IL-22联合TNF-α等细胞因子促进State3的磷酸化并且上调了Stat3的表达，从而促进寻常型银屑病角质形成细胞的增生以及炎性反应的形成［10］。同时IL-22通过上调了S100A7、S100A8、S100A9的表达，且诱导角质形成细胞表达β-防御素，抵抗了相关微生物的侵袭，并抑制了炎性反应的发生，从而调控并且维持了表皮细胞的稳定性［11］。（3）IL-22能通过与IL-17、IL-20、IL-23等其他细胞因子的相互作用，从而起到扩大炎性反应，促进银屑病棘层增生的作用［12］。（4）IL-22主要在角质形成细胞中表达，但有一部分也可以表达于表皮成纤维细胞中［12］，而本实验在免疫荧光结果中银屑病患者皮损的表皮IL-22高表达，也验证了这一观点。

目前，国内对于IL-22与寻常型银屑病间关系的研究探讨多集中在血清学检测，针对IL-22在本病患者的皮损中表达的研究较少。本实验通过应用实时定量PCR法及免疫荧光的检测技术对IL-22在寻常型银屑病患者和正常对照组患者的皮损中的表达进行了对比，从而发现进展期银屑病组患者的皮损中IL-22的表达明显高于正常对照组（P＜0.05），此结果提示IL-22与寻常型银屑病患者的发病有着密切的联系。本研究提出了银屑病免疫治疗的新方向，也提供了基因药物治疗的一个新思路。

［1］赵辨.中国临床皮肤病学（下册）［M］.南京：江苏科学技术出版社，2010：1008-1025.

［1］Xie MH，Aggarwal S，Ho WH，et al.Interleukin（IL）-22，a novel human cytokine that signals through the interferon receptor-related proteins CRF2-4 and IL-22R［J］.J Biol Chem，2000，275（40）：31335-31339.

［2］Dumoutier L，Van Roost E，Am eye G，et al.IL-TIF/IL-22：genom icorganization and mapping of the human and mouse genes［J］.Genes Immun，2000，1（8）：488-494.

［3］Kotenko SV，Izotova LS，Mirochnitchenko OV，et al.Identification of the functional interleukin-22（IL-22）receptor complex［J］.J Biol Chem，2001，276（4）：2725-2732.

［4］Wolk K，Kunz S，Witte E，et al.IL-22 increases the innate immunity of tissues［J］.Immunity，2004，21（2）：241-254.

［5］Wolk K，Witte E，Warszawska K，et al.The Th17 cytokine IL-22 induces IL-20 production in keratinocytes：a novel immunological cascade with potential relevance in psoriasis［J］.Eur J Immunol，2009，39（2）：3570-3581.

［6］Wolk K，Haugen HS，Xu W，et al.IL-22 and IL-20 are key mediators of the epidermal alterations in psoriasis while IL-17 and IFN-gamma are not［J］.J Mol Med，2009，87（8）：523-536.

［7］Haider AS，Lowes MA，Suarez-Farinas M，et al.Identification of cellular pathways of“type 1，”Th17 T cells，and TNF-and inducible nitric oxide synthase-producing dendritic cells in autoimmune inflammation through pharmaco-genomic study of cyclosporine A in psoriasis［J］.J Immunol，2008，180（4）：1913-1920.

［8］Boniface K，Guignouard E，Pedretti N，et al.A role for T cell-derived interleukin 22 in psoriatic skin inflammation［J］.Clin Exp Immunol，2007，150（5）：407-415.

［9］Kagami S，Rizzo HL，Lee JJ，et al.Circulating Th17，Th22，and Th1 cells are increased in psoriasis［J］.J Invest Dermatol，2010，130（5）：1373-1383.

［10］Cavani A，Pennino D，Eyerich K.Th17 and Th22 in skin allergy［J］.Chem Immunol Allergy，2012，96（1）：39-44.

［11］Zheng Y，Danilenko DM，Valdez P，et al.Intedenkin 22，a T（H）17 cytokine，mediates IL-23 induced dermal inflammation andacanthosis［J］.Nature，2007，445（7128）：648-651.

［12］Lerman G，Sharon M，Leibowitz-Amit R，et al.The crosstalk between IL-22 signaling and miR-197 in human keratinocytes［J］. PLos One，2014，9（9）：1-12.

（编辑武玉欣）

R758.63

A

0258-4646（2015）04-0362-03

张晓岚（1984-），女，医师，硕士研究生.

姜奕，E-mail：jiangyi@hotmail.com

2014-09-13

网络出版时间：