水通道蛋白1对MCF-7人乳腺癌细胞增殖能力的影响

李 卓，王 瑶，辛 娜，田 宇，李建华，康 炜(西安医学院第一附属医院检验科，西安 710077;通讯作者，E-mail:kang_wei 2008@126．com)

水通道蛋白1(aquaporin，AQP1)是一种广泛存在于生物细胞膜上的能高效特异转运水的膜通道蛋白，在多种肿瘤组织中有表达［1-4］，研究表明其在肿瘤生长、侵袭及瘤周水肿的形成等方面具有重要作用［5-7］。因此，通过抑制AQP1的高表达，或许可以成为阻碍肿瘤发生发展的一种有效手段。前期研究中我们已证实乳腺癌组织中广泛表达AQP1蛋白，提示AQP1可能参与了乳腺癌的发生发展［8］，但关于其在乳腺癌发病过程中的作用及具体机制目前尚不明确。在此基础上，本研究采用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术特异性沉默AQP1基因，转染人MCF-7乳腺癌细胞，检测沉默AQP1对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，旨在为乳腺癌的临床诊断和基因治疗奠定理论基础。

1 材料与方法

1．1 重组质粒载体的构建

根据 GeneBank中人AQP1基因的已知序列(BC022486 2764 bp mRNA)，选择其基因编码区的4个19nt的寡核苷酸序列作为靶点，由上海吉凯公司设计并合成相应的cDNA模板序列，并以一条无意序列作为阴性对照。与之对应的shRNA表达载体由上海吉凯公司构建并超纯，分别命名为AQP1-shRNA1、AQP1-shRNA2、AQP1-shRNA3 和 AQP1-shRNA4(表1)，经测序鉴定，结果正确。

表1 AQP1-shRNA序列Table 1 Sequences of AQP1-shRNA

1．2 细胞分组与转染

实验分为正常对照组(细胞不做任何处理)、阴性对照组(转染非特异性质粒)和4个AQP1-shRNA转染组，每组设3复孔。操作按照Invitrogen公司LipofectamineTM2000试剂说明书进行。每孔加入4 μg 质粒，37 ℃，5%CO2培养箱中培养6 h，更换含有血清的新鲜培养基继续培养。荧光显微镜下观察，转染细胞呈绿色荧光，未转染的细胞不显色。随机选择5个视野取其平均值，分别计算转染细胞数和总细胞数，二者比值即为细胞转染率。

1．3 qRT-PCR法检测MCF-7细胞AQP1 mRNA的表达

转染MCF-7细胞后48 h，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，并以其为模板进行real-time PCR。20 μl反应体系:10 μl 2 × SYBR®Premix Ex TaqTM，正、反向引物(10 μmol/L)各 0．4 μl，ROXReference Dye Ⅱ 0．4 μl，cDNA 2 μl，双蒸水 6．8 μl。各设 3个复孔，反应条件为:95℃ 30 s预变性，95℃ 3 s、60℃30 s，40个循环。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，采用 2-ΔΔCt法［9］进行计算 AQP1 基因的相对表达量。AQP1基因引物序列为:上游:5＇-GATCACACACAACTTCAGCAACCA-3＇，下游:5＇-TTCACGCGGTCTGTGAGGTC-3＇;内参基因 β-actin的引物序列为:上游:5＇-TGGCACCCAGCACAATGAA-3＇，下 游:5＇-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGGA-3＇，均由TAKARA公司合成。

1．4 Western blot检测 MCF-7细胞 AQP1和Caspase-3的表达

细胞转染48 h后收集细胞并提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量。配制12%的凝胶，取25 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE，电转膜，封闭，TBST洗膜后分布加入兔抗人AQP1、Caspase-3抗体(1∶1 000)及β-actin抗体(1∶2 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)，采用Odyssey红外荧光扫描成像系统进行结果扫描和分析。

1．5 CCK-8法检测MCF-7细胞增殖活性

转染后 0，12，24，48，72 h 进行 CCK-8 法检测细胞增殖活性。具体操作按试剂盒说明进行，每组3复孔，采用酶标仪在450 nm处检测吸光度值(OD450)，绘制细胞增殖曲线。

1．6 流式细胞术检测细胞凋亡率

培养48 h后，收集并计数1×106个细胞，重悬于结合缓冲液，分别加入FITC标记的Annexin-Ⅴ和碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，避光室温孵育10 min，立即上机采用流式细胞仪检测分析。

1．7 统计学分析

采用SPSS 17．0软件进行统计学分析，两组间比较数据采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，数据以±s表示，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 AQP1-shRNA重组质粒载体的构建及细胞转染

构建的四组AQP1-shRNA重组质粒经DNA测序证实与所设计的序列完全一致，表明靶向AQP1基因的shRNA表达载体构建成功。构建好的重组质粒用脂质体法转染MCF-7人乳腺癌细胞，转染48 h后，倒置相差荧光显微镜下观察，其转染效率约为50%。

2．2 转染 AQP1-shRNA后 MCF-7细胞中 AQP1 mRNA的表达

qRT-PCR法检测结果显示，转染48 h后，与正常对照组相比，四组shRNA中AQP1 mRNA的相对表达水平均不同程度减低，分别为0．68±0．05，0．63 ±0．04，0．47 ±0．06 和 0．29 ±0．03，表达抑制率分别为 32．37%，36．63%，53．20% 和 70．54%，其中以AQP1-shRNA4组干扰效率最高。

2．3 转染AQP1-shRNA后MCF-7细胞中AQP1蛋白的表达

转染后48 h，Western blot检测结果显示，四组shRNA处理组细胞中AQP1蛋白水平均不同程度低于正常对照组，表达抑制率分别为29．93%，31．42%，54．88% 和 72．42%，其中以 AQP1-shRNA4 转染后AQP1蛋白水平降低最为显著(见图1)。

图1 AQP1-shRNA转染MCF-7细胞后AQP1蛋白表达量Figure 1 The expression level of AQP1 protein in MCF-7 cells after transfected with AQP1-shRNAs

2．4 AQP1对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响

根据qRT-PCR法和Western blot检测结果，选择AQP1-shRNA4进行后续试验。共分为三组:正常对照组(细胞不做任何处理)、阴性对照组(转染非特异性质粒)和 AQP1-shRNA4组(转染 AQP1-shRNA4)。

2．4．1 CCK-8法检测AQP1对MCF-7细胞增殖的影响 CCK-8检测结果显示，正常对照组和阴性对照组细胞的体外增殖能力并无明显差异。AQP1基因表达沉默后，MCF-7细胞体外增殖活性从48 h开始受到显著抑制，与正常对照组之间具有显著性差异(P ＜0．05，见图2)。

图2 AQP1对MCF-7细胞增殖的影响Figure 2 Effect of AQP1 on cell proliferation in MCF-7 cells

2．4．2 流式细胞术检测AQP1对MCF-7细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，AQP1-shRNA4转染组MCF-7细胞凋亡率较正常对照组显著增加(27．77 ±2．82)%(P ＜0．05)，而正常对照组和阴性对照组之间凋亡率未见统计学差异(P＞0．05)，分别为(15．26 ±1．06)%和(15．93 ±1．00)%(见图3)。2．4．3 AQP1对MCF-7细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的影响 Western blot检测结果显示，与正常对照组和阴性对照组相比，AQP1-shRNA4组细胞中的Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P＜0．05，见图4)。

图3 流式细胞术检测AQP1对MCF-7细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of AQP1 on cell apoptosis in MCF-7 cells detected by FCM

图4 AQP1表达沉默对MCF-7细胞中Caspase-3蛋白的影响Figure 4 The protein levels of Caspase-3 in MCF-7 cells after transfected with AQP1-shRNA4

3 讨论

现有研究表明，AQP1在前列腺癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤组织、细胞系及微血管内皮细胞中表达水平升高［3，10-12］，正因为 AQP1与多种疾病的发生和发展密切相关，目前已成为众多学者研究的热点。但关于其在乳腺癌发病过程中的作用及对乳腺癌细胞生长的具体影响目前国内外尚少有报道。前期研究中，我们采用免疫组织化学法检测了106例乳腺癌组织及20例正常癌旁组织中的AQP1表达水平，结果表明，乳腺癌组织中广泛表达AQP1蛋白，提示AQP1可能参与了乳腺癌的发生发展［8］。基于此，本研究利用RNAi技术沉默AQP1基因的表达，进一步探讨AQP1在MCF-7乳腺癌细胞增殖及凋亡中的作用，旨在为肿瘤的分子靶向治疗提供新的理论依据。

RNA干扰技术是近年来发展起来的一项基因阻断技术，可以特异地沉默目的基因的表达，以便快捷地研究该基因的功能［13，14］。shRNA 是一段具有紧密发卡环的RNA序列，常被用作RNA干扰沉默靶基因的表达工具［15］。本研究中，我们首先构建了4个靶向AQP1的shRNA重组质粒，将其分别转染人乳腺癌MCF-7细胞后，根据qRT-PCR和Western blot检测结果筛选出干扰效果最佳的AQP1-shRNA4进行后续试验。

肿瘤细胞具有无限的复制增殖潜能，是恶性肿瘤的一个重要生物学特性。因此，降低肿瘤细胞的增殖率是治疗肿瘤的有效途径之一。本研究采用RNA干扰技术抑制AQP1基因在MCF-7人乳腺癌细胞株中的表达，CCK-8法检测结果显示AQP1基因表达沉默后，随着AQP1表达量的减少，MCF-7细胞增殖能力随之受抑。应用AnnexinⅤ FITC/PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示转染AQP1-shRNA后MCF-7细胞的凋亡率显著升高。此外，采用Western blot法检测细胞凋亡的标志性分子Caspase-3，结果显示AQP1沉默后 MCF-7细胞中Caspase-3蛋白的表达水平升高。这就提示水通道蛋白在乳腺癌发生发展过程中具有重要作用，阻断AQP1，肿瘤细胞的增殖速度会迅速减慢，并会诱导肿瘤细胞发生凋亡，但其具体机制尚有待进一步探索。

综上，本研究通过 RNA干扰试验证实沉默MCF-7人乳腺癌细胞中的AQP1基因，可以有效抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，提示AQP1在乳腺癌的发生发展中具有重要作用，有望成为乳腺癌分子治疗的潜在靶标。

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