连翘不同部位活性成分含量分析

李丹凤，李石飞，张立伟(山西大学分子科学研究所，太原 030006;通讯作者，E-mail:lwzhang@sxu．edu．cn)

连翘(Forsythia suspensa(Thunb．)Vahl)为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物。中国药典［1］记载，秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称青翘;果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称老翘。连翘是一种传统中药，以果实入药，具有清热解毒，散结消肿等功效。由于历版《中国药典》中均未区分青翘和老翘，加上市场对连翘的需求量大，导致了近年来连翘的主产区均出现了“抢青”现象，市场上已经少有老翘供应了。自古以来，连翘的使用都是以老翘为主，那么现如今普遍地用青翘代替老翘入药是否合理?同时，有人［2］依据2010版《中国药典》规定连翘的指标性成分是连翘酯苷A和连翘苷，研究出连翘叶可以替代果实入药，这样的质量标准是否具有合理性，是否应该提升连翘的标准而不是简单一两个指标成分含量测定而已?此外，连翘早春先叶开花，花量大，花期长，花色长久不褪，具有很好的观赏价值，其花是一种资源丰富的黄色食用色素源［3］，在民间有用连翘花泡茶的习俗。目前关于连翘不同部位化学成分的研究，多集中于连翘果实和连翘叶中，对连翘花的研究鲜有报道［4］。针对以上问题，本实验对连翘不同部位——花、叶、果实(青翘和老翘)中的(+)－松脂素－β－D－葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁和连翘苷4种成分进行了含量分析，旨在为连翘的多标准质量评价提供证据，为连翘其他药用部位的合理利用和对连翘资源的充分开发提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司);SB－3200 DTS超声波扫频清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Sarturius-BS110S分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);冰醋酸(色谱纯，美国Fisher Scientific);甲醇(分析纯，天津市北辰方正试剂厂);芦丁(纯度:98% 批号:100080－200707)(中国药品生物制品检定所)、连翘酯苷A(纯度:92．9% 批号:111810－201103)(中国药品生物制品检定所);连翘苷、(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷为本实验室自制;实验用水为纯净水。

选山西大学校园内种植的4株连翘为样株(经山西大学张立伟教授鉴定，为木犀科连翘属连翘)，采集部位为4株连翘的花(3月)、叶(7月)、果实［青翘(7月)和老翘(10月)］。自然阴干，粉碎成末，过筛，备用。

1．2 提取分离

(1)分别精密称定芦丁、连翘酯苷A、连翘苷、(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷标准品各1．0 mg，加入甲醇分别定容于10 ml容量瓶中，作为对照品溶液备用。

(2)分别精密称定连翘花、叶、青翘、老翘的粉末各1 g，置于具塞锥形瓶中，加入50%甲醇溶液100 ml，称重，超声提取1 h，冷却，称重，加50%甲醇补足失重量。静置，取上清液，过0．45 μm有机滤膜，取其滤液，作为供试品溶液。

1．3 色谱条件及线性方程

［5］中方法，采用Zorbax XDB C18色谱柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，Zorbax XDB C18预柱(12．5 mm ×4．6 mm，5 μm)。流动相为甲醇(A)－0．3%醋酸水溶液(B)，梯度洗脱(0－8 min:30%－33%甲醇;8－24 min:33%－40%甲醇;24－39 min:40%－48%甲醇;39－55 min:48%－64%甲醇)。流速为0．8 ml/min，检测波长280 nm，柱温25℃，进样量 10 μl。

本研究所用仪器、分析色谱柱以及流动相条件完全参照文献［5］条件，借鉴其相关线性方程(见表1)，在其线性范围内，对4种化合物的含量进行测定。

表1 四种化合物的线性方程Table 1 Calibration curves of the four constituents

2 结果

2．1 含量测定

取连翘不同部位样品—花、叶、青翘、老翘，分别作3个平行处理，按照1．2项下方法制备供试品溶液，按照1．3项下色谱条件进样测定。对照品及供试品的HPLC图谱见图1。

以外标法计算，按干燥品计各供试品中的(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁和连翘苷的含量，结果见表2。

结果显示，(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷在连翘花中的含量最高，可达到22．63 mg/g，在叶中的含量最低，仅有8．99 mg/g。连翘的主要活性成分连翘酯苷A在青翘中含量最高，可达62．28 mg/g，其次为老翘、叶和花。芦丁和连翘苷在叶中的含量最高，分别为6．97 mg/g和45．57 mg/g。老翘中芦丁含量仅为0．64 mg/g，叶中芦丁为其10倍之多。花中连翘苷含量最低，为0．65 mg/g，叶中含量为其70倍之多。

图1 对照品及供试品的HPLC图谱Figure 1 HPLC Chromatograms of reference substances and samples

表2 供试品中四种活性成分含量测定结果(mg/g±s，n=3)Table 2 Contents of the four active constituents of samples(mg/g，±s，n=3)

表2 供试品中四种活性成分含量测定结果(mg/g±s，n=3)Table 2 Contents of the four active constituents of samples(mg/g，±s，n=3)

样品 (+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷 连翘酯苷A 芦丁 连翘苷花22．63 ±0．49 9．41 ±0．19 5．46 ±0．19 0．65 ±0．03叶8．99 ±0．10 40．34 ±0．83 6．97 ±0．16 45．57 ±0．61青翘 21．78 ±0．20 62．28 ±1．14 1．63 ±0．03 16．68 ±0．14老翘16．93 ±0．05 51．58 ±2．15 0．64 ±0．01 9．20 ±0．09

2．2 单因素方差分析

采用SPSS软件对连翘不同部位中4种成分进行了单因素方差分析(One-way ANOVA)，结果见图2。

单因素方差分析所得均 P=0．000＜0．05，表明连翘不同部位，即花、叶和果实(青翘和老翘)中(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁和连翘苷的含量具有统计学差异。

图2 连翘不同部位中4种成分含量Figure 2 The contents of four constituents in different parts of Forsythia suspensa

2．3 主成分分析

对连翘花、叶、青翘和老翘中的4个成分采用SIMCA-P软件进行主成分分析PCA(principal components analysis)，由主成分(t1)和主成分(t2)为横纵坐标构建的得分散点图可见，花位于散点图左下部，叶位于散点图右下部，而青翘和老翘分布于右上部，花、叶和果实中各成分含量有明显的分离趋势(见图3)，说明四种成分在各部位中的含量具有统计学差异。

3 讨论

3．1 实验结果分析

图3 连翘不同部位中四种成分的主成分分析图Figure 3 Principal components analysis of four constituents in different parts of Forsythia suspensa

由表1可知，随着连翘的生长，(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷、连翘酯苷A、芦丁和连翘苷四种成分在各个部位的变化趋势各不相同。结果显示果实(青翘和老翘)中连翘酯苷A含量最高，(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷次之，芦丁含量最低，且青翘中各成分含量均高于老翘，与高淑丽等［6］所测山西连翘的结果一致。叶中连翘苷含量最高，是花中含量的70倍，这与文献［7，8］结果趋势相同，且倍数相同。由于本实验所用样品皆为校园采集的一种，受气候、地理环境等因素的影响，与其他产地的连翘药材有一定差异，如孙印石等［4］表明，连翘花中芦丁的含量非常高，在山东各地含量最低的也可达到19．53 mg/g，大于本实验中的5．46 mg/g。虽然具体含量不尽相同，但花中(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷＞连翘酯苷A＞芦丁＞连翘苷的含量大小趋势与孙印石等研究结果是一致的。

3．2 建议增加连翘质量评价指标

据文献［9］报道，连翘中所含的主要化学成分为黄酮类、苯乙醇及其苷类、木脂素类、三萜类、C6-C2天然醇类等。本实验所研究的(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷(木脂素类)、连翘酯苷A(苯乙醇苷类)、芦丁(黄酮类)、连翘苷(木脂素类)为连翘的主要活性成分，具有降血压、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等药理作用［10，11］。2010版《中国药典》中以连翘酯苷A含量不少于0．25%和连翘苷含量不少于0．15%的标准控制连翘的质量。本实验结果表明，连翘酯苷A在含量最少的连翘花中也达到了0．9%，其他的均远高于药典标准。而连翘苷的含量除了连翘花中含量不及标准，连翘叶、青翘、老翘中的含量均超过了药典标准。此外，本实验结果显示(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷在不同部位中的含量仅次于连翘酯苷A，不容忽视;而不同部位中芦丁的含量差别较大。因此认为药典中仅以连翘苷和连翘酯苷A两种化学成分的含量作为评价指标，并不能充分保证连翘药材的质量，建议中国药典增加(+)－松脂素-β-D-葡萄糖苷和芦丁作为连翘的指标性成分，以多个指标同时对药材进行质量控制。尽管连翘叶中连翘酯苷A和连翘苷的含量均超过了药典规定的值，但是我们从表1中可发现四种成分在叶、青翘和老翘中含量变化趋势是不一致的，连翘叶中芦丁和连翘苷的含量相对较高，而青翘和老翘中(+)－松脂素－β-D－葡萄糖苷和连翘酯苷A含量相对较高，可见单纯的以连翘酯苷A和连翘苷含量标准来评定“连翘叶代替连翘药用具有可行性”［2］是不科学的。最后，尽管2010版《中国药典》并未区分青翘和老翘，通过本研究可以发现两者的化学成分含量是存在差异的，建议分别建立青翘和老翘的质量标准，以期能更好地控制连翘产量和质量，更具有实际意义。

参考文献:

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［M］．北京:化学工业出版社，2010:159－160．

［2］李志荣，杨光义，叶方，等．连翘不同药用部位质量比较研究［J］．中国药业，2014，23(11):5－7．

［3］盛锋，付蕾，李长城，等．连翘花黄色素的提取及其对光热稳定性的研究［J］．食品与发酵工业，2002，28(2):66－70．

［4］孙印石，王延杰，王建华．高效液相色谱法测定不同产地连翘花中四种有效成分含量［J］．食品安全质量检测学报，2014，5(9):2791－2795．

［5］Guo H，Liu AH，Li L，et al．Simultaneous determination of 12 major constituents in Forsythia suspensa by high performance liquid chromatography-DAD method［J］．JPBA，2007，43(3):1000－1006．

［6］高淑丽，刘丽华，张阳．高效液相色谱法同时测定不同产地、不同炮制时间连翘和连翘叶中5种活性成分的含量［J］．中国医院药学杂志，2012，32(16):1276－1279．

［7］张飞，田粟，吕明霞，等．HPLC同时测定连翘花及叶中绿原酸等活性成分的含量［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17(9):103－106．

［8］曹晓燕，王东浩，思培峰，等．连翘不同部位连翘苷含量的比较［J］．中成药，2009，31(4):642－644．

［9］李倩，冯卫生．连翘的化学成分研究进展［J］．河南中医学院学报，2005，20(2):78－80．

［10］朴香兰，田燕泽．连翘木脂素类成分研究现状［J］．时珍国医国药，2010，21(8):2021－2023．

［11］刘明，中药连翘的药理作用的研究近况［J］．现代医药卫生，2007，23(16):2438－2439．