黄花棘豆在腐解过程中的化感作用及其土壤细菌群落结构分析

何玮，郭琳微，樊鹏辉，郭斌，傅艳萍，尉亚辉

（陕西省生物技术重点实验室，西北大学生命科学学院，西北大学西部草原毒害草研究中心，陕西 西安710069）

黄花棘豆（Oxytropisochrocephala），俗称马绊肠、团巴草等，为豆科棘豆属多年生草本植物。黄花棘豆主要分布在我国甘肃、宁夏、青海、四川和西藏等地区，是我国西部草场的主要毒害草之一，其含有神经毒素苦马豆素（swainsonine），牲畜误食后易引起病症甚至死亡，对畜牧业造成了非常大的损失［1－2］。随着我国草原放牧强度逐年增加，加之全球气候变化剧烈，黄花棘豆在我国天然草原不断蔓延［3］，但以灭除为主的传统防控方法容易对草场的生态环境造成进一步破坏。近年来，对黄花棘豆等毒草的防控逐渐转为生态控制。因此，为了对其进行有效防控，明确其在草场的竞争优势机制显得尤为重要。

前人研究表明，黄花棘豆根系较发达，种子繁殖数量多，抗逆性强，容易在草原上形成优势种群，抑制其他植物的生长，降低草原的生物多样性，引起草原退化，破坏草原的生态平衡［4］。化感作用是植物在生长过程中获得竞争优势的一种重要手段，而关于黄花棘豆的化感物质和释放途径、作用机理已有报道［3－5］。这些工作大多是通过人工控制的黄花棘豆水浸提液处理其他植株来完成的，为黄花棘豆的化感作用研究奠定了基础。但同时，黄花棘豆在自然状态下是否对其伴生植物具有显著的化感作用还需要进一步研究。自然环境下，植物残株在土壤中的自然腐解过程中可能会对其他植物造成影响，因此在实验室或野外环境下模拟植物腐解过程，是一种研究植物化感作用的有效方法。例如，周淑清等［6］研究发现，狼毒（Stellerachamaejasme）的地上部分和地下部分腐解对苜蓿（Medicagosativa）的株高、干重、叶面积、叶绿素含量均产生一定的抑制作用。黄花棘豆在土壤中的自然腐解过程中是否对其他植物的生长表现出化感作用？其是否通过与根系细菌群落之间的相互作用间接影响其他植物的生长？以上问题还研究较少。因此，有必要对相关问题进行研究和探讨。相关研究可以为更好地寻找黄花棘豆的有效防控提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物与土壤材料采集

黄花棘豆全株材料采于2012年8月，采样地点为青海省祁连县（N 37°57′13.62″，E 100°18′51.12″，海拔3780m）。采集后的植物材料保存于4℃条件下，于48h内带回实验室以备后续研究；植物材料粉碎后过40目筛（0.425mm），保存在4℃冰箱备用。实验选择紫花苜蓿和黑麦草（Loliumperenne）作为化感作用目标材料，种子同年购于江苏圣源种业有限公司。

黄花棘豆根系与非根系土壤样品采集于2013年6月，采样地点为宁夏自治州海原县（N 36°26′49.80″，E 105°37′26.46″，海拔2656m）。在0.5km2植被覆盖均一的范围内，根据是否有黄花棘豆生长随机选取5点；黄花棘豆根系土壤为实验组（实验编号2.1），并以5m范围内无黄花棘豆生长的非根系土壤作为对照组（实验编号2.2）。用钢土钻采集土样，采样深度为0～25cm，取得土壤剥去表层2cm以去除表层土干扰。将实验组和对照组各5个新鲜土样混匀后，分别装于2个牛皮纸袋中，保存于干冰冷冻箱内，于24h内带回实验室后置于－80℃冰箱保存备用。

1.2 黄花棘豆在土壤中的腐解对两种牧草生长的影响

2012年8月，在植物材料采集后1周内，将含有1%，2%，3%，4%和5%黄花棘豆全株粉碎物的营养土（w／w）装入培养盆中，每盆土壤总重为200g，同时将不含有黄花棘豆粉碎物的等重营养土组作为对照。紫花苜蓿和黑麦草种子在培养皿上发芽后，随机挑选发芽和生长情况较好、形态一致的2种牧草种子各180粒，播种于5个不同浓度处理组和1个对照组中（共6组），每组3盆作为3组重复，每盆10粒种子。植物材料培养于光照培养箱内，培养条件为：光强3000lx，光照14h，25℃；黑暗10h，18℃，植物生长所需浇水量参照周淑清等［7］。培养10d后，每盆选生长最优的定苗3株。60d后，按照周淑清等［7］的方法测定各组紫花苜蓿和黑麦草株高、生物量（干重）和叶绿素含量。

1.3 黄花棘豆根系微生物群落成分及组成比例分析

2013年6月，在土壤采集后1周内按照李靖宇等［8］的方法对黄花棘豆根系土和非根系土总DNA进行提取。提取的土壤总DNA用0.8%的琼脂糖凝胶检测完整性，并使用BioSpec－nano分光光度计（岛津，日本）测定DNA的浓度及纯度。以土壤总DNA为模板，选择16SrDNA V3区序列进行PCR扩增，扩增用正反向引物合成于上海生工公司，序列为341－F：TTACCGCGGCTGCTGGCAC，534－R：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG。25μL PCR反应体系为：DNA模板75ng，正反引物（10μmol／L）各1.5μL，Hot Start Taq PCR Master Mix（Takara，日本）12.5μL，补双蒸水至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，循环数35；72℃延伸7min；12℃保存［9］。

扩增产物（黄花棘豆根系土，实验编号2.1；非根系土，实验编号2.2）于Illunima2000?平台进行MiSeq双端测序，以Green Genes为参考序列数据库，使用Uclust软件根据序列相似性进行聚类；参考Green Genes数据库用软件RDP classifier进行物种注释，并统计在不同分类水平上土壤中的细菌物种构成；OTUs Heatmap和Venn图使用python脚本语言和 R语言编写脚本完成；使用 EstimateS（Version 9，http：／／purl.oclc.org／estimates）对根系土和非根系土组内微生物多样性指数进行计算；使用Excel 2010软件制作物种组成的柱状图和饼状图。

1.4 数据处理与分析

实验1.2中所有测定指标均为3次生物学重复，用SPSS 19.0分析软件新复极差检验法（SSR法）进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 黄花棘豆在土壤中的腐解对两种牧草生长的影响

黄花棘豆在土壤腐解过程中对紫花苜蓿生长的影响和其在土壤中的含量相关（表1）。当黄花棘豆含量达到5%时，对紫花苜蓿的株高产生极显著抑制作用（P＜0.01），而其他处理之间均无显著性差异；生物量方面，低含量的（≤3%）黄花棘豆处理对紫花苜蓿的生物量无显著性影响，但当黄花棘豆含量达到4%时，开始显示出极显著的抑制作用（P＜0.01）；紫花苜蓿中叶绿素（a＋b）在黄花棘豆含量2%时开始降低，和对照差异极显著（P＜0.01），表明黄花棘豆的化感抑制作用强烈，并随着土壤中黄花棘豆含量的增加而下降。

表1 黄花棘豆在土壤中的腐解对紫花苜蓿生长的影响Table 1 Effect of O.ochrocephalaon the seedling growth of M.sativaduring the decay process in soil

黄花棘豆在土壤中的腐解对黑麦草生长的影响同样呈现出和其在土壤中含量相关的趋势（表2）。黄花棘豆对黑麦草的株高没有显著的抑制作用，且当其含量在1%～3%时，对黑麦草的株高具有促进作用。生物量方面，4%～5%含量处理组对黑麦草显示出极显著的抑制作用（P＜0.01），黑麦草平均干重为0.1240和0.1270g，比对照组下降约20%。叶绿素（a＋b）含量的差异分析表明，各处理组间差异较大；4%～5%处理组降低了叶绿素浓度（P＜0.01），而低含量处理组对叶绿素浓度无影响，甚至具有促进作用。当土壤中黄花棘豆含量在2%时，黑麦草的株高和干重均达到最高，分别为50.17cm和0.1656g／株，而土壤中黄花棘豆含量在1%时，黑麦草的叶绿素（a＋b）浓度最高，为0.9590mg／g。

表2 黄花棘豆在土壤中的腐解对黑麦草生长的影响Table 2 Effect of O.ochrocephalaon the seedling growth of L.perenne during the decay process in soil

2.2 黄花棘豆生长土壤微生物群落差异

2.2.1 测序质量评估，数据回归及OTUs统计

黄花棘豆16SrDNA V3区PCR扩增产物为194 bp，扩增产物条带单一，满足后续测序要求。对根系土（实验组编号：2.1）与非根系土（对照组，编号：2.2）样品进行数据质量检测；单碱基平均质量得分在30以上，测序质量较好；序列质量得分为37，表明质量很高，低质量碱基占比较少。单土样测序深度分析（Rarefaction Curve）表明测序深度已覆盖土样中的所有物种，测序的序列数目也满足分析要求。

表3 每个土样中序列及OTU的数量Table 3 Number of sequence and OTU（Operational Taxonomic Units）of each soil sample

图1 根系土和非根系土样OTUs维恩图Fig.1 OTUs Venn diagram of two soil samples

用Uclust软件根据序列相似性进行聚类，得到序 列 聚 类 单 元（Operational Taxonomic Units，OTU）；选择97%作为序列相似性阈值，并对每个土样的序列数进行统计。根系土的聚类单元数比非根系土对照组少779个（表3），表明对照组土壤中细菌的多样性可能更高。两个土样包含的OTUs的交叉情况用Venntu展示（图1），并存的OTUs有3669个，单独存在于根系土的OTUs有1081个，而非根系土有1860个特异性OTUs，和根系土相比略高。

2.2.2 土壤细菌群落组成与结构分析 土壤细菌群落比对分析显示，黄花棘豆根系土（2.1）和非根系土（2.2）在门级别上的细菌主要为7个门（图2），这些细菌占总检测细菌群落92%以上。黄花棘豆根系和非根系土细菌组成存在较大的差异——不同门级别下的细菌占总细菌群落的比例不同，这主要体现在根系土中属于变形菌门（Proteobacteria），疣微菌门（Verrucomicrobia），芽单胞菌门（Gemmatimonadetes），厚壁菌门（Firmicutes）的细菌丰度比非根系土相应的门的细菌丰度分别提高16.53%，1.45%，2.32%，1.76%；与之对应的是放线菌门（Actinobacteria），酸杆菌门（Acidobacteria），硝化螺旋菌门（Nitrospirae），细菌在根系土组中的丰度比非根系土组低15.43%，4.67%，0.44%。未知菌门在根系土和非根系土组中各占4.07%和6.22%，表明这些细菌不能在门级别被归类。同样，纲级别的根系土和非根系土在细菌菌群的类型上没有太大的差异，但是每个纲级别下菌群的比例存在着较大的差异（数据未展示）。

图2 黄花棘豆土壤微生物群落结构图（门级）Fig.2 The soil microbial community structure（Phylum level）

图3 土壤微生物群落结构图（目级）Fig.3 The soil microbial community structure（Order level）

目级与科级结合（图3，图4）的微生物细菌群落分类对比表明，黄花棘豆根系土壤与非根系土壤中细菌种类的差异在这两个分类级别上主要表现为酸杆菌门（Acidobacteria）iii 1－15目，变形菌门伯克氏菌目（Burkholde－riales），变形菌门黄色单胞菌科（Xanthomonadaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae），变形菌互营杆菌科（Syntrophobacteraceae），放线菌门Gaiellaceae（科），厚壁菌门芽孢杆菌科（Bacillaceae）等。这些目和科的细菌在根系土和非根系土中所占比例相差很大（图3，图4）。由于土壤细菌微生物多样性非常高，数据库比对结果显示在科级和属级下还存在着很多不能被分类的细菌，自科级开始，有很多的细菌无法再被细分，图4结果统计显示科级和属级下不能被辨别（未知）的微生物分别达到了60%和90%左右，此外，从两组样品的OTU聚类图可以看出，大部分OTU在根系土和非根系土细菌群落的丰度在纲（class）级别以下差异较小，仅有少部分OTU的丰度差异在4～8倍（22～23）以上。

图4 土壤微生物群落OTUs heat map分类聚类图Fig.4 Heat map of bacterial OTUs from the two edaphic samples

2.2.3 物种多样性指数分析 一系列的物种α多样性指数可以反映各群落内微生物多样性的丰富度［10］。黄花棘豆根际土及非根系土的细菌群落多样性分析表明，两者在细菌群落组成上的多样性指数差异不大，根际土细菌群落丰度较非根系土略低；但非根系土的细菌种类更多，其种间遗传距离和也远远大于根系土（表4）。

表4 物种多样性指数Table 4 Species diversity index

3 讨论

自然界中植物化感作用的例子已多见报道，如黑胡桃树（Juglansnigra），其释放的水溶性羟基胡桃苷虽然无毒，但经水解和氧化后生成的次生代谢产物胡桃醌对共生植物具有强烈的毒性，使得草本植物不能够在黑胡桃树下存活［11－12］；鼠尾草（Salvialeucophylla）中含有的挥发性萜类物质是造成其周围植物死亡的主要原因［13］；欧石楠（Heathwort）和荭草（Polygnlumorientale）的根系分泌物对多种作物的生长具有强烈的抑制作用［14］。目前，使用供体植物的水浸提液、土壤腐解液、淋溶和根系分泌物质来研究植物的化感作用是本领域研究的主要手段，但是如何能够尽可能在模拟自然环境下研究植物间的生长关系，是揭示化感作用更加合理的方式。本文的实验结果表明，黄花棘豆在土壤腐解过程中，对紫花苜蓿和黑麦草两种牧草的生长均表现出高浓度的抑制特性，对紫花苜蓿的抑制作用更为明显；而黑麦草对黄花棘豆的化感作用较不敏感，说明黑麦草对黄花棘豆的化感作用具有一定的抗性。同时，低浓度黄花棘豆处理两种牧草未表现出显著的抑制效应，甚至有部分促进作用。天然草原群落中黄花棘豆是否对群落中的其他植物起化感作用，可能取决于其植株密度；在低密度的情况下，黄花棘豆的蔓延可能与其他因素相关。

植物化感的方式可以是直接的，如通过根系分泌的化合物来抑制其他植物生长，也可能是间接的，即通过根系与土壤微生物环境进行物质与信号的交流对其他植物起到抑制作用［15］。微生物群落在植物与土壤间起着非常重要的作用，植物分泌的化感物质既可以通过改变微生物群落实现利己性，也可以通过对病原菌种类和数量的调控，降低病原菌浸染对植物所造成的负调控作用，保证植物的正常生长［16］。在生态系统中，逃离天敌假说（enemy release）认为，土壤微生物环境在与本地植物长期的共同进化过程中，多数情况下形成对本地植物稳定的负反馈作用，以此制约某种特定的本地植物生长，达到物种多样性平衡；当某物种脱离原生地的土壤微生物群落时，由于脱离了原生地土壤微生物环境的负反馈，容易形成优势种［17］。本研究结果表明，黄花棘豆根系土和非根系土细菌微生物群落种类相似，但部分分类单元的微生物所占比例差异较大，这些差异可能与黄花棘豆的扩散有着密切的关系。例如变形菌门（Proteobacteria）在黄花棘豆根系土中的丰度比非根系土高16.53%，门水平下进一步细分后显示变形菌伯克氏菌目（Burkholderiales）和海洋螺菌目（Oceanospirillales）的丰度都在根系土中较高。这和已报道的在玉米（Zeamays）、橡树（Quercuspalustris）和拟南芥（Arabidopsisthaliana）中的结果相似［18］。变形菌门细菌被广泛认为可以高效同化土壤中植物根系分泌的不同类型的含碳化合物，为自身的快速生长提供碳源，因此变形菌门细菌通常在细菌群落中体现出一种“机会主义”生长的趋势。变形菌门细菌在黄花棘豆根系土细菌群落中丰度较高，表明这类细菌可以利用黄花棘豆根系土中的碳源并和黄花棘豆形成一定的共生，但这种共生作用与同一植物群落的其他植物表现较弱；通过这种共生作用，黄花棘豆也可能会从中获益以促进自身的生长。同时，Mendes等［19］在对甜菜（Betavulgaris）的研究中发现，在不同土壤中生长的甜菜，当土壤微生物中变形菌门中伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、黄色单胞菌科（Xanthomonadaceae）和假单胞菌科（Pseudomonadaceae），放线菌乳杆菌科（Lactobacillaceae）的相对比例增加到一定程度的时候，病原菌立枯丝核菌所引起的作物枯死病就能得到有效控制；已有研究证实，假单胞科菌类可以通过释放抗真菌类抗生素的方式，抑制土壤中一些如尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）、禾顶囊壳菌（Gaeumannomycesgraminis）等病原菌对植物的侵害，并诱导植物提高自身对病原菌的抗性［20－21］。黄花棘豆根系土中的伯克氏菌科、黄色单胞菌科和假单胞菌科丰度均高于非根系土，当多种菌门的微生物数量达到一个相对丰度时，而非某一菌类及其数量的变化，会形成抑制病原菌的土壤微生物群落，增强植物抗性［22］。

黄花棘豆非根系土细菌群落中放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）细菌丰度比根系土组中分别高15.43%和4.67%。放线菌门细菌是广泛存在于土壤中的一大类细菌，其中放线菌纲（Actinobacteria）放线菌目（Actinomycetales）中的一些细菌会在土壤中起抑制植物病原菌和促进植物生长的作用，如部分链霉菌属（Streptomyces）和小单胞菌属（Micromonospora）细菌［23］。但虽然黄花棘豆非根系土中放线菌门细菌的丰度高于根系土组，但是此差异主要是由油菌纲（Thermoleophila）Gaiellales目细菌造成的。由于目前Gaiellales目细菌的功能还未知，因此此类型细菌的丰度变化会对黄花棘豆或其伴生种的生长造成怎样的影响还未知。酸杆菌门细菌是研究较晚的一类细菌，它的一个显著特点是生长在营养成分较为缺乏的土壤中，生长缓慢，因此较难分离和培养，且其功能还不是非常清楚，但是可以作为较贫瘠土壤环境的指示［24］，这反映出在同一群落中，和其伴生种相比，黄花棘豆生长的土壤养分情况可能更好，通过养分的富集来改善自身生长的土壤条件。由于土壤细菌群落结构多样，种类复杂，除上述细菌之外，其他一些类别的细菌在科属水平以下不能被细分。黄花棘豆根系土和非根系土中细菌结构的差异，可能是黄花棘豆获得生长优势的重要原因。同时，黄花棘豆极有可能在生长或者腐解过程中对土壤微生物群落有一定的影响，但黄花棘豆的腐解对土壤微生物群落结构有怎样的影响还有待进一步的深入研究。

4 结论

综上所述，本文通过黄花棘豆在土壤中的腐解过程研究了其在自然状态下的化感作用，结果表明高浓度的黄花棘豆对紫花苜蓿和黑麦草的生长具有显著性的抑制作用，其对两种牧草光合作用的破坏作用有待进一步研究［25］。通过16SrDNA测序，比较了黄花棘豆根系与非根系土细菌群落组成，结果显示两组细菌群落在部分分类单元的比例上有较大差异。黄花棘豆可能通过化感物质的释放，改变土壤中不同种类细菌的比例及某类基因的特异性表达，建立利己性的微生物群落，同时抑制病原菌的侵害，最终促进自身生长，并抑制其他共生种。因此，黄花棘豆在部分草原的大量滋生可能与其特定的土壤微生物环境更有利于其生长有关。本研究可为黄花棘豆的有效防控提供一定的理论依据。

［1］The Flora of China Editorial Committee.Flora Reipublicae Popularis Sinicae［M］.Beijing：Science Press，1998：21－24.

［2］Li Q，Li J N，Tao S L，etal.Research progress on toxicity，harm and prevention ofOxytropis.Pratacultural Science，2009，26（4）：99－105.

［3］Li X.Study on Allelopathy Mechanism of Natural Meadow Poisonous PlantsOxytropisochrocephala［D］.Lanzhou：Gansu Agricultural University，2011.

［4］Dong Q.Releasing Mode and Isolated and Identified of Main Allelochemicals fromOxytropisochrocephalaL.［D］.Lanzhou：Gansu Agricultural University，2012.

［5］Deng J M.Investigation on Main Poisonous Plants in Tianzhu Natural Meadow and Study on Allelochemicals ofOxytropis ochrocephalaBunge［D］.Lanzhou：Gansu Agricultural University，2009.

［6］Zhou S Q，Wang H，Huang Z J，etal.Research on allelopathy ofStellerachamaejasmein decompose process in the soil on alfalfa.Chinese Journal of Grassland，2008，30（4）：78－82.

［7］Zhou S Q，Huang Z J，Wang H，etal.Allelopathic effect ofStellerachamaejasmedecomposing in soil onOnobrychisviciifolia.Pratacultural Science，2009，26（3）：91－94.

［8］Li J Y，Zhao J，Bian Y，etal.DNA extraction and removing humic substance from wetland soil.Microbiology China，2010，37（8）：1130－1137.

［9］Lu P，Li H，Wu Y S，etal.Extraction methods of microbial DNA from the desert grassland soil in Inner Mongolia.Journal of Inner Mongolia University（Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nei Mongol），2008，39（4）：430－434.

［10］Lozupone C A，Knight R.Species divergence and the measurement of microbial diversity.FEMS Microbiol Review，2008，32（4）：557－578.

［11］Rietveld W J.Allelopathic effects of juglone on germination and growth of several herbaceous and woody species.Journal of Chemical Ecology，1983，9（2）：295－308.

［12］Davis E F.The toxic principle ofJuglansnigraas identified with synthetic juglone and its toxic effects on tomato and alfalfa plants.American Journal of Botany，1928，15：62.

［13］Muller C H.Inhibitory terpenes volatilized from salvia shrubs.Bulletin of the Torrey Botanical Club，1965，92：38－45.

［14］Zhao F G，He L F，Luo Q Y.Plant Stress Physiology and Ecology［M］.Beijing：Chemical Industry Press，2004：9－36.

［15］Inderjit，van der Putten W H.Impacts of soil microbial communities on exotic plant invasions.Trends in Ecology ＆ Evolution，2010，25（9）：512－519.

［16］Berendsen R L，Pieterse C M J，Bakker P A H M.The rhizosphere microbiome and plant health.Trends in Plant Science，2012，17（8）：478－486.

［17］Wolfe B E，Klironomos J N.Breaking new ground：soil communities and exotic plant invasion.Bioscience，2005，55（6）：477－487.

［18］Peiffer J A，Spor A，Koren O，etal.Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome underfield conditions.Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110（16）：6548－6553.

［19］Mendes R，Kruijt M，de Bruijn I，etal.Deciphering the rhizosphere microbiome for disease－suppressive bacteria.Science，2011，332：1097－1100.

［20］Weller D M，Raaijmakers J M，Gardener B B M，etal.Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens.Annual Review of Phytopathology，2002，40：309－348.

［21］Haas D，Défago G.Biological control of soil－borne pathogens by fluorescent pseudomonads.Nature Reviews Microbiology，2005，3（4）：307－319.

［22］Klironomos J N.Feedback with soil biota contributes to plant rarity and invasiveness in communities.Nature，2002，417：67－70.

［23］Sasikumar A P，Seung H Y，Zhang L，etal.Effects of actinobacteria on plant disease suppression and growth promotion.Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（22）：9621－9636.

［24］Jason A P，AyméS，Omry K，etal.Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110（16）：6548－6553.

［25］Ye X Q，Wu M，Shao X X，etal.Effects of water extracts fromSolidagocanadensison the growth of maize seedlings and the underlying photosynthetic mechanisms.Acta Prataculturae Sinica，2014，23（6）：217－224.

参考文献：

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第42卷第二分册）［M］.北京：科学出版社，1998：21－24.

［2］李泉，李俊年，陶双伦，等.棘豆的毒性、危害及防治.草业科学，2009，26（4）：99－105.

［3］李翔.天然草地有毒植物黄花棘豆化感作用机理研究［D］.兰州：甘肃农业大学，2011.

［4］董强.黄花棘豆化感物质释放途径及主要化感物质分离鉴定［D］.兰州：甘肃农业大学，2012.

［5］邓建梅.天祝天然草地主要有毒植物资源调查及黄花棘豆化感作用研究［D］.兰州：甘肃农业大学，2009.

［6］周淑清，王慧，黄祖杰，等.狼毒在土壤里腐解过程中对苜蓿化感作用的研究.中国草地学报，2008，30（4）：78－82.

［7］周淑清，黄祖杰，王慧，等.狼毒在土壤里腐解过程中对红豆草生化他感作用的研究.草业科学，2009，26（3）：91－94.

［8］李靖宇，赵吉，边玉，等.湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术.微生物学通报，2010，37（8）：1130－1137.

［9］卢萍，李浩，吴永胜，等.内蒙古荒漠草地土壤微生物DNA提取方法的研究.内蒙古大学学报（自然科学版），2008，39（4）：430－434.

［14］赵福庚，何龙飞，罗庆云.植物逆境生理生态学［M］.北京：化学工业出版社，2004：9－36.

［25］叶小齐，吴明，邵学新，等.加拿大一枝黄花水提液对玉米幼苗生长的化感作用及其机理［J］.草业学报，2014，23（6）：217－224.