句容地区草莓枯萎病病原菌的分离鉴定及田间防治

吴 祥， 姚克兵， 吉沐祥， 陈宏州， 杨敬辉， 李金凤， 王莉莉

(1.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400;2.江苏省绿盾植保农药实验有限公司，江苏 句容 212444)

草莓(Fragaria ananassa Duch.)是多年生草本植物，因其果实色泽艳、营养高、风味浓，而备受栽培者和消费者的青睐［1-6］。近年来，草莓种植面积逐年增大，品种不断更新，频繁地调种、引种以及连作，导致草莓枯萎病蔓延。再加上草莓灰霉病、白粉病、“v”型褐斑病、蛇眼病、炭疽病、红中柱根腐病、根结线虫病、病毒病和革腐病［7-14］等不断发生且日益严重，给种植户带来较大经济损失。

据报道，引起枯萎病的病原物主要有细菌性病原(如玉米细菌性枯萎病菌)和真菌性病原(如瓜类枯萎病菌)两大类［15］。目前，研究较多的是镰刀菌属病原菌［16］，其中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)［17］和尖孢镰刀菌草莓专化型(Fusarium oxysporum f.sp.fragariae)是主要病原菌。枯萎病主要分布在美国、日本、澳大利亚和中国［18］，从苗期到收获期的整个栽培过程中都会发生。目前生产上对该病害仍以化学防治为主，常用恶霉灵、多菌灵和甲基托布津、代森锰锌等杀菌剂灌根防治，因连续多年使用这些药剂，防治效果逐年降低，甚至达到无法控制的程度［19］。

句容地区种植草莓时间较早，发展规模和产业化开发水平在中国乃至东南亚享有较高知名度。近几年随着草莓品种更新和产业升级加快，红颊草莓因大果率高、丰产性好、耐贮运、甜度高、香味浓等特点，深受栽培者与消费者欢迎，已经成为句容地区大棚草莓主导品种，但苗期极易感炭疽病、枯萎病，移栽后枯萎病、炭疽病为害仍然严重，往往会造成毁灭性死苗，对农民种植红颊草莓的积极性造成很大的打击，给红颊草莓品种的推广和农户致富带来较大阻力［20］。

目前国内外对草莓枯萎病的研究报道有:手塚信夫［21］利用从草莓植株体内分离的非致病性镰刀菌对草莓枯萎病进行了生防试验，证明在健康植株上接种非致病性镰刀菌可有效地防止草莓枯萎病发生。牧野孝宏［22］用非致病性尖孢镰刀菌菌液浸草莓根，草莓未发生枯萎病。De Rodríguez 等［23］发现佛头菊(Flourensia)浸提液对镰刀菌有较好的防治效果。曾富春等［24］对草莓枯萎病病原菌的生物学特性进行了研究。杨焕青等［19］对采自山东省烟台市草莓枯萎病菌株进行了生物学特性以及7种化学杀菌剂对草莓枯萎病菌的抑制作用研究。陈桂平等［25］2007-2008年对汕头市草莓枯萎病田间发病情况进行调查和田间化学药剂防治试验，结果表明，该病在草莓定植后21 d开始发病，田间发病常出现2个明显的高峰:一个高峰出现在第1次喷施“九二0”7 d后，另一个高峰出现在11月底覆盖薄膜之后7 d左右。化学药剂处理后，初期发病率均较低，随着时间的推移，发病率越来越高，不同药剂之间差异不明显。于红梅等［26-27］应用PCR技术，结合形态学手段，对从江苏省农业科学院草莓生产基地采集的草莓枯萎病病原菌进行分离鉴定，并进行生物学特性研究，并采用生长速率法进行了4种化学杀菌剂对草莓枯萎病病原菌室内毒力的测定，结果表明，4种参试杀菌剂对草莓枯萎病病原菌的抑制效果随着杀菌剂浓度增大抑制效果增强，百菌清抑制效果较好，而乙嘧酚、噻菌铜、二氰蒽醌3种杀菌剂抑制效果相差不大。贾冬梅［28］用自然高温土壤灭菌法对棚栽草莓枯萎病有较好防治效果。由于生防菌在土壤中定殖受诸多因素影响，制剂商业化困难，因此在生产中很少使用［29］。

本研究对江苏省句容市草莓枯萎病进行了调查，对分离到的病原菌进行形态和分子鉴定以及致病性试验，选用6种生物或低毒化学药剂对草莓枯萎病进行了田间防治试验，为该病害的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病害调查

2013年10月23 日至2013年11月1日，对句容市天王镇、二圣乡、白兔镇3地的98个大棚(随机选择)进行草莓枯萎病发生情况进行调查，观察病害症状，并拍照。同时采集具有典型枯萎病症状的标本带回实验室作为试验材料。

1.2 病原菌的分离及纯化

将草莓根上的泥土洗净，取病健交界处的组织，在超净台上用0.1%升汞进行表面灭菌 (2～3 min)，然后用灭菌水洗3次，每次1 min，再用灭菌过的镊子将分离组织转移到PDA平板培养基上，共81皿，每皿5块，置于PRX-250A型智能人工气候箱内培养［相对湿度70%，黑暗，(25±2)℃］。培养第5 d检查、记录分离到的菌落数量和菌落形态，统计真菌和细菌的出现频率，并进行编号。用挑针挑取菌落边缘的幼嫩菌丝进行纯化培养，4℃保存［30］。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 形态观察 草莓枯萎病菌属于半知菌亚门、丝孢纲、镰刀菌属的真菌，观察分生孢子梗和分生孢子的形态和产生情况，可采用载玻片培养法［31］培养2～3 d，在德国蔡斯Imager.A1型光学显微镜下观察分生孢子梗和分生孢子形态，拍照，测量分生孢子梗和分生孢子大小(n=30)。根据病原菌的形态特点、培养性状，结合相关资料进行病原菌鉴定［32-35］

1.3.2 分子鉴定

1.3.2.1 提取DNA 步骤如下:(1)真菌纯化培养后收集菌体轻微离心，将菌丝收集在微管(Microtube)底部;(2)使用Pipette Tip尖端按压菌体10次左右，进行物理破碎;(3)加入400 μl的提取液1［Tris-HCl 100 mmol/L(pH8.0)，EDTA 50 mmol/L(pH8.0)，NaCl 500 mmol/L］，WH-861旋涡混合器(江苏金坛华龙实验仪器厂生产)剧烈振荡5 s(3 000 r/min);(4)轻微离心，加入80 μl的提取液2(20%SDS)，产生白色沉淀，剧烈振荡5 s后，溶液呈白浊状态;(5)轻微离心，加入150 μl的5 mol/L KAc，剧烈振荡5 s;(6)轻微离心2 s，于50℃温浴15 min;(7)12 000 r/min 4℃离心15 min;(8)取上层水相移至新的1.5 ml微管中;(9)添加等量的异丙醇(浓度≥99.7%)，轻柔混匀;(10)12 000 r/min 4℃离心10 min;(11)弃上清液，加入1 ml 70%乙醇，清洗沉淀;(12)12 000 r/min 4℃离心3 min;(13)弃上清液，沉淀干燥，加入适量TE Buffer(约20 μl)溶解沉。

1.3.2.2 PCR扩增 采用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3')扩增整个ITS序列。PCR体系如下:10 × Buffer 3 μl，Primer F/R(10 pmol/L)各 1 μl，dNTP 1 μl，聚合酶 1 μl，PCR 产物 0.5 ～1.0 μl，超纯水30 μl。PCR反应过程为94℃预变性5 min;94℃变性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环;72℃反应后延伸3min，4℃暂时保存。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行回收纯化，引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3.2.3 测序反应 在0.2 ml离心管中配置如下体系:超纯水 5 μl，Primer(3.2 pmol/L 单引物)1 μl，Template 0.3 ～0.5 μl，BDT3.1 1 μl，PCR 反应过程为:96℃预变性5 min;96℃变性30 s，50℃退火5 s，60℃延伸3 min，35个循环;60℃反应后延伸3 min，4℃暂时保存。清洗沉淀并上机反应，测序仪采用ABI 3730XL。测序结果通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性比对。ITS序列的测序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4 致病性测定

在室温条件下，用分离得到的菌株制成的孢子悬浮液(在显微镜10×10倍镜下，孢子浓度以视野中含有50～100个孢子为宜)涂抹接种健康草莓的根部，以蒸馏水为对照，重复3次，每次10株，接种后保湿24 h，每7 d观察1次。按照柯赫法则进行验证，以确认所分离的真菌是否为致病菌。

1.5 试验药剂

1.5.1 田间试验药剂 1×109CFU/g多黏芽孢杆菌(JX-13)WP(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产);1%申嗪霉素SC(上海农乐生物制品有限公司生产);1 g含6×108有效活性菌数的哈茨木霉T-22GR(荷兰科伯特公司生产);1×1011CFU/g枯草芽孢杆菌(DJ-6)WP(江苏省绿盾植保农药实验有限公司加工生产);1 g含1×106个孢子的寡雄腐霉WP(捷克生物制剂有限公司生产);250 g/L吡唑醚菌酯EC(巴斯夫欧洲公司生产)。

1.5.2 田间试验设计 试验设在句容市石狮镇农户邬平章草莓大棚中(2012年枯萎病发生严重田块)，2013年夏季高温闷棚处理61 d。草莓品种为红颊，2013年9月8日定植，定植时灌根1次，每株药液量均为200 ml，7 d后灌根1次，共防治2次。用清水灌根作为对照。

药剂浓度与处理方法:(1)1×1011CFU/g枯草芽孢杆菌(DJ-6)WP 1000倍液;(2)1×109CFU/g多黏芽孢杆菌(JX-13)WP 1000倍液;(3)1 g含1×106个孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液;(4)1%申嗪霉素SC 900倍液;(5)1 g含6×108有效活性菌数的哈茨木霉T-22GR 500倍液;(6)250 g/L吡唑醚菌酯EC 2000倍液;(7)空白对照为清水。每处理3次重复，每小区50 m2，田间随机区组排列。

2 结果与分析

2.1 草莓枯萎病的田间症状

草莓枯萎病主要危害根部，从开花至收获期均可发生，发病初期草莓植株的心、叶变为黄绿色或黄色，有的蜷缩呈波状产生畸形叶，病株叶片失去光泽，植株生长衰弱，在三出复叶中往往有1～2片小叶畸形或者变小、硬化，且多发生在植株的一侧。老叶呈紫红色萎蔫，叶片枯黄，最后全株枯死(图1)。受害植株的根冠部、叶柄、果梗维管束都变成褐色或黑褐色。草莓枯萎病可导致草莓结果减少，果实无法正常生长膨大，品质降低，甚至全株枯死［19］。

2.2 病原菌分离与鉴定

2.2.1 分离结果 本研究共分离405块草莓枯萎病植株根部组织，其中从381块草莓枯萎病植株根部组织中分离到真菌，占被分离草莓枯萎病植株根部组织总量的94.1%;分离到镰刀菌(Fusarium oxysporum)的草莓枯萎病植株根部组织276块，占分离到真菌的72.4%，分离到绿木霉(Trichoderma viride Pers.ex Fr.)的草莓枯萎病植株根部组织41块，占分离到真菌的10.8%，分离到球黑孢菌(Nigrosporasphaerica Mason)的草莓枯萎病植株根部组织7块，占分离到真菌的1.8%;分离到其他真菌的草莓枯萎病植株根部组织57块，占分离到真菌的15.0%;分离到细菌的草莓枯萎病植株根部组织24块，占被分离草莓枯萎病植株根部组织总量的5.9%。

2.2.2 形态学特征 尖孢镰刀菌(Fusarium oxysoporum Schl.)，在 (25±2)℃的PDA培养基上(相对湿度70%，黑暗)，菌落初为白色，渐变为灰色和淡紫色(图2 A)，平均日生长量为27 mm，气生菌丝绒毛状，灰色。在人工培养过程中未出现有性世代。分生孢子梗单生(图2 B)，直立，无色，大小 (6.3～63.8)μm×(1.9～2.8)μm，小型分生孢子在分生孢子梗顶端形成假头状，无色，大多数为单细胞，椭圆形、圆柱形，少量弯曲(图 2C)，大小 (4.7～12.6)μm×(2.7～4.2)μm;大型分生孢子梭形，稍弯曲，两端尖，多为 3个分隔(图 2 D)，大小(21.0～40.4)μm×(3.2～5.8)μm，少数为 4～5个分隔，大小 (33.2～56.3)μm×(3.7～6.3)μm;厚垣孢子多，中生，厚壁(图 2 E)，大小 (9.0～17.6)μm×(8.2～15.8)μm。

图2 尖孢镰刀菌的形态学特征Fig.2 Morphological characteristics of Fusarium oxysporum

2.2.3 分子鉴定 提取尖孢镰刀菌菌丝DNA，用ITS1和ITS4的通用引物进行PCR扩增，得到长度为546 bp的特异性DNA片段，扩增ITS区全序列(图3)。对扩增片段进行测序，用NCBI的Blast在Gen-Bank中搜寻相似序列。结果与GenBank中登陆号为EF495230.1(包括18 S核糖体RNA基因的部分序列，内转录间隔区1，5.8 S核糖体RNA基因全序列，内转录间隔区2全序列和28 S核糖体RNA基因部分序列)的同源性为100%，因此，确定草莓上分离到的菌株为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)。

2.3 病原菌的致病性

草莓植株接种22 d后，全部发病，45 d后全部枯死，症状与田间发病相同，对照不发病(图4)。将接种后发病的植株进行再次分离，分离到了同样的病菌，符合柯赫氏法则。由此证明分离到的病原菌为草莓枯萎病病原菌。

图3 ⅠTS 1和ⅠTS 4区域的PCR扩增产物电泳图Fig.3 PCR ofⅠTS 1 and ⅠTS 4 of Fusarium oxysporum

图4 草莓枯萎病菌的致病性Fig.4 Pathogenicity of strawberry fusarium wilt pathogen

2.4 田间防治效果

田间试验第1次调查(施药后30 d)结果表明，250 g/L吡唑醚菌酯EC 2 000倍液、1%申嗪霉素SC 900倍液防治效果均为100%，两者均极显著好于其他参试药剂处理;1×109CFU/g多黏芽孢杆菌(JX-13)WP1000倍液、1 g含1×106个孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液、1 g含6×108有效活性菌数的哈茨木霉T-22GR 500倍液的防治效果均为82.61%，极显著好于1×1011CFU/g枯草芽孢杆菌(DJ-6)WP 1 000倍液的防治效果(表1)。

第2次调查(施药后51 d)结果表明，250 g/L吡唑醚菌酯EC 2 000倍液的防治效果为93.11%，极显著好于其他参试药剂的防治效果;1×109CFU/g多黏芽孢杆菌(JX-13)WP 1 000倍液、1 g含1×106个孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液、1%申嗪霉素SC 900倍液的防治效果均为58.63%，显著好于1×1011CFU/g枯草芽孢杆菌(DJ-6)WP 1 000倍液的防治效果和1 g含6×108有效活性菌数的哈茨木霉T-22 GR 500倍液的防治效果。

3 讨论

表1 6种药剂对草莓枯萎病田间防治效果调查表Table 1 The field control effects of 6 fungicides on strawberry fusarium wilt

本研究共分离405块草莓枯萎病植株根部组织，得到381株真菌，全部为半知菌亚门的真菌，其中镰刀菌属的真菌(Fusarium)占真菌种类的72.4%。通过形态特征观察和DNA测序结果分析确认草莓枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysoporum Schl.)。致病性试验结果证明，草莓植株接种22 d后全部发病，症状与田间发病相同，再次分离得到了同样的病原菌，符合柯赫氏法则。6种农药对草莓枯萎病田间防治效果试验结果显示，250 g/L吡唑醚菌酯EC 2 000倍液防治效果最佳，1%申嗪霉素 SC 900倍液的防治效果次之。1×109CFU/g多黏芽孢杆菌(JX-13)WP 1 000倍液、1 g含1×106个孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液等均有一定防治效果。

随着草莓种植面积的不断扩大，多种草莓病害不断发生，且有加重的趋势，主要原因是草莓种苗带菌和同一地块多年连作所致，此外，也有可能是病原菌发生变异，产生新菌株或生理小种所致。针对这些问题，有必要寻找一种较安全、有效的病害控制措施，以达到阻止病害发生，保障草莓产业的持续健康发展。

从目前对草莓枯萎病等病害的防治措施来看，种植户仍以化学药剂为主，生物农药为辅，应用化学药剂防治植物病害，虽能快速有效地达到防治目的，但长期单一使用，病原菌会产生抗药性［36］。应力求推荐符合草莓高效安全标准化生产要求的植物源和微生物源农药。生物防治在应用中对环境较安全，污染较小，成本较低，成为了目前研究和开发的热点［37］。王占武等［38］报道了连续 2 年使用拮抗菌(B.subtilis)在草莓根际定植防治草莓枯萎病具有很好的的效果;吴加志等［39］发现肠杆菌属(Enterobacter spp.)和假单孢菌属(Psudomonas spp.)中的一些菌对由尖孢镰刀菌引起的枯萎病具有明显的防治效果;Porras等［40］利用太阳能土壤消毒和木霉菌(Trichoderma)结合的方法，得出在太阳高温消毒后再添加生物菌剂的方法防治草莓枯萎病也具有很好的效果;陈义群等［41］研究发现优化施肥模式对控制草莓枯萎病有显著的作用。

新型低毒化学杀菌剂吡唑醚菌酯与生物药剂申嗪霉素防治效果最好，多种微生物菌剂均有一定效果。我们在实际生产中应用草莓连作大棚夏季太阳能高温消毒处理，草莓定植后采用生物药剂灌根1～2次，能基本控制枯萎病等连作病害的发生。为进一步提高生物农药的防治效果，需对微生物菌剂间混用效果或微生物菌剂与吡唑醚菌酯、申嗪霉素等混用效果做进一步研究。

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