葡萄酒中10种多酚类物质的高效液相色谱－四极杆/静电场轨道高分辨质谱测定方法研究

宓捷波，毕玉国，赵孔祥，李淑静，许 泓，何 佳，郑文杰

(天津出入境检验检疫局，天津 300461)

多酚类物质是葡萄酒的重要组成成分，主要包括非类黄酮和类黄酮两大类，这些物质对葡萄酒的色泽、苦味、收敛性等感官特性和贮藏时间具有决定性作用［1－3］。研究表明，多酚类物质还对人体具有重要的生理功效，可以提高高密度脂蛋白，防止动脉粥样硬化，抑制冠心病，消除自由基，减少诱变剂致癌，解毒护肝等［4－6］。因此，检测葡萄酒中多酚类物质的种类和含量对于监控葡萄酒产品质量、引导人们健康消费具有重要意义。

目前，葡萄酒中多酚类物质的检测大多采用液相色谱法(HPLC)［7－10］，该方法具有灵敏度高、稳定性好和易于操作的特点，但由于结构相近的多酚类物质在色谱行为上不易区分且葡萄酒中存在其他杂质的干扰，HPLC无法准确定性。一些研究［11－13］采用液相色谱－电喷雾离子阱法测定红酒中的多酚类物质，利用质谱碎片信息进行定性，但由于一些多酚类物质的分子量较小(如香豆素的分子量为164)，无法获得足够的碎片信息以满足国内外法规关于定性确证的要求。而高分辨质谱技术利用高分辨性和精确质量信息进行定性，可弥补上述技术的不足。本研究结合四极杆/静电场轨道高分辨质谱(QE HRMS)的全扫描和目标离子二级扫描技术，通过对液相色谱条件及碰撞能量的优化，建立了葡萄酒中10种多酚类物质的准确定性和定量检测技术，为有效监管和分析葡萄酒产品提供了有力的技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高压液相色谱－四极杆/静电场轨道阱质谱仪(QE，美国Thermo－fisher公司)，配有VIM阀切换和多柱切换模块(MCM)。Avanti J－30I高速冷冻离心机(美国Beckerman Coulter公司)，MS3basic涡旋混合器(美国IKA Weake公司)，HS 501振荡反应器(美国IKA Weake公司)，Xcel VapTM自动氮吹浓缩仪(美国Horizon公司)。乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸(色谱纯，德国Merck公司)，儿茶素、槲皮素二水合物、没食子酸、2，5-二羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、反式阿魏酸、反式p-香豆素、反式白藜芦醇标准品(美国Sigma－Aldrich公司)。浓盐酸(分析纯，天津化学试剂厂)。实验一般用水为去离子水，用于HPLC及质谱的水为电阻率小于18.2 MΩ·cm的超纯水。

1.2 混合标准储备液的配制

准确称取10 mg各标准品，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得1.0 mg/mL标准储备液，于－18℃避光保存。分别取100 μL上述标准液混合于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成100 μg/mL的混合标准储备液，－18℃避光保存。

1.3 色谱－质谱条件

色谱条件:ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm);流速0.3 mL/min;进样量10 μL;流动相:A为0.5%的乙酸水，B为甲醇。洗脱程序:0～1 min，95%A;1～10 min，95%～10%A;10～14 min，95%A。

质谱条件:采用全扫描(Full scan)和目标离子二级扫描(Target MS2)结合方式，负离子模式，全扫描离子范围:100～500 m/z，分辨率35 000，质量偏差5 ppm。鞘气流速:0.72 L/min，辅助气流速:3.3 L/min，喷雾电压:2.75 kV，毛细管温度:280℃，离子源加热温度:350℃，归一化的碰撞能量(Normalized collision energy，NCE):35 eV。高分辨质谱离子信息及碰撞能量见表1。利用全扫描结果外标法定量，Target MS2结果定性。

表1 10种多酚类物质的HPLC－QE HRMS质谱参数Table 1 Mass spectral parameters of HPLC－QE HRMS for 10 polyphenols

1.4 样品前处理

取1 mL葡萄酒与9 mL水混合，用浓盐酸调至pH 2.0，加入3 mL乙酸乙酯，振荡提取10 min，3 500 r/min离心5 min，取上清液至15 mL离心管中，重复提取3次，合并提取液，于30℃水浴中氮吹至干，用10 mL 50%甲醇水复溶。取100 μL复溶液，与900 μL 50%甲醇水混合，过0.22 μm尼龙滤膜后进样检测。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的优化

葡萄酒中多酚类物质通常采用有机溶剂(乙醚或乙酸乙酯)液液萃取［7－9］或固相萃取(SPE)［7］方式进行提取。与固相萃取相比，液液萃取法操作相对简单。而Malovana［7］和陈建业［9］等的研究表明，液液萃取法的提取效率优于SPE法，故本研究采用乙酸乙酯液液萃取的方式进行提取。考察了pH值分别为2.0，4.0，7.0时的提取结果(图1)，结果显示，pH 2.0时各物质的提取效率最高，这可能与目标物质在pH 2.0时均呈分子状态，更易溶于有机相有关，故本研究采用pH 2.0作为提取溶液酸度。

图1 不同pH值条件下多酚类物质的提取效果Fig.1 Extraction effect of polyphenols in different pH values

2.2 流动相的优化

多酚类物质通常具有带1个或多个羟基的芳环结构，在负离子模式下检测可获得较强的质谱信号［14－16］。依据负离子模式检测时物质离子化的特点，若流动相中含酸会抑制目标物的离子化，所以以水为流动相。但以甲醇－水为流动相时，多酚类物质在色谱柱上的峰形严重拖尾，而加入少量乙酸后，峰形明显改善。为兼顾多酚类物质的峰形和响应值，分别在流动相中添加0.1%，0.2%，0.5%，1.0%的乙酸进行测定，结果表明，以含0.5%乙酸的水溶液与甲醇为流动相时多酚类物质的响应最佳。图2分别为以水－甲醇和0.5%乙酸水－甲醇为流动相时香草酸的全扫描谱图，以水－甲醇为流动相时峰形拖尾且分叉(图2A)，而0.5%乙酸水－甲醇流动相下香草酸的峰形完好且响应高(图2B)。香草酸的保留时间在不同流动相时相差近1 min，这可能是由于流动相呈酸性时香草酸大多以分子状态存在，极性降低，所以在C18柱上的保留更强。

图2 香草酸在不同流动相下的全扫描谱图Fig.2 Full scan chromatograms of vanillic acid using different mobile phases

2.3 多酚类物质的定性定量测定

由于葡萄酒中含有大量的基质干扰物，如何对目标物进行准确定性显得尤为重要。根据欧盟EC/657指令规定，用质谱检测确认目标物时需要3～4个识别点，一般低分辨率质谱的前体离子(Precursor ion)为1个识别点，碎片离子(Fragment ion)为1.5个识别点，所以利用低分辨质谱进行目标物定性确认时需要1个前体离子和2个碎片离子。但由于部分多酚类物质的结构较小(如没食子酸、香豆素和咖啡酸等)，而且均带有含酚羟基的芳环结构，一般的质谱条件下只能获得1个明显的碎片离子，故利用低分辨率质谱进行这些物质的确证存在缺陷。图3显示了咖啡酸的碎裂质谱图，从图中可以看出，前体离子经碎裂后只有1个明显的碎片离子。因此，文献均采用质谱与二极管阵列检测器(DAD)联用［11－13］，以相同保留时间点的特征吸收峰进行辅助定性，但这一技术要求每个物质在色谱柱上实现完全分离，整个分析时间长达70～90 min。而高分辨率质谱由于具备高质量精度和高分辨率的特点，其前体离子为2个识别点，碎片离子为2.5个识别点，所以用高分辨质谱进行小分子多酚类物质检测时，1个前体离子和1个二级特征碎片离子可以满足定性识别的要求。而且多个扫描事件同时扫描的模式可在一次分析过程内同时进行全扫描和Target MS2扫描，利用全扫描获得的前体离子进行定量，Target MS2获得的碎片离子进行定性即可，所以分析时间大大缩短。

图3 咖啡酸的质谱图Fig.3 MS profile of caffeic acid

2.4 标准曲线与定量下限

以50%甲醇水配制10种多酚类物质的混合标准溶液，其浓度分别为0.001，0.005，0.01，0.1，1.0，10 mg/L，进行高分辨质谱检测，以化合物的响应峰面积(y)为纵坐标，其对应浓度(x，mg/L)为横坐标，拟合标准工作曲线。表2结果显示，10种多酚类物质在相应浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。以不同水平稀释后分析化合物响应的信噪比(S/N)大于10计算方法的定量下限(LOQ)，得到各物质的 LOQ 为0.000 5～0.002 5 mg/L。文献研究表明［7－9，11－12］，每升葡萄酒中上述10种多酚类物质的含量一般为mg级，所以，本方法的灵敏度可以满足葡萄酒中多酚类物质稀释100倍后的检测需要。图4为实际葡萄酒中10种多酚类物质的全扫描提取离子色谱图，图中目标物出峰明显，不存在干扰。

表2 10种多酚类物质的标准曲线与定量下限Table 2 Standard curves and limits of quantitation of 10 polyphenols

2.5 回收率与精密度

鉴于多酚类物质在葡萄酒中普遍存在，完全空白的酒样不易获得，而模拟酒样又难以反映样品的真实属性，所以加标回收实验选择多酚含量较低的白葡萄酒作为添加基质，分别添加1，5，10 mg/L(没食子酸为5，10，20 mg/L)的多酚类混合标准，提取定容后稀释至100倍进行测定。由于方法的LOQ远低于真实酒样中的含量，所以LOQ的加标回收实验选择在模拟酒样(12%乙醇水溶液，以酒石酸调至pH 3.0)中添加0.000 5～0.002 5 mg/L多酚混合标准，提取定容后直接进行定量检测。由表3可见，10种多酚类物质的加标回收率为82.0%～109.1%，相对标准偏差(RSD)均小于10%。

图4 葡萄酒中10种多酚类物质的全扫描提取离子色谱图Fig.4 Full scan chromatograms of 10 polyphenols in wine

表3 葡萄酒中添加10种多酚类物质的回收率与相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 10 polyphenols spiked in wine(n=6)

2.6 实际样品的测定

采用本方法对天津口岸进口的来自8个国家11批次葡萄酒中的多酚类物质进行测定，结果显示，不同产区葡萄酒中的多酚类物质含量差异较大(表4)。总体而言，干白葡萄酒(Dry white wine)中10种多酚物质的含量明显低于干红葡萄酒(Dry red wine)，这可能与干红和干白葡萄酒的原料和处理工艺有关。在10种多酚类物质中，没食子酸、儿茶素、咖啡酸、香豆素、丁香酸和槲皮素的含量相对较大，这与文献报道［8－9］一致，但各种多酚类物质的含量和比例在不同产地的葡萄酒中无明显规律，这可能是不同葡萄酒存在不同的风味特征和感官特性的原因。

表4 11种葡萄酒中10种多酚类物质的含量Table 4 Contents of 10 polyphenols in 11 wines ρ/(mg·L－1)

3 结论

本研究利用QE高分辨质谱的高分辨和精确质量信息的特点，结合全扫描和目标分子二级扫描技术，建立了葡萄酒中10种多酚类物质的准确定性和定量检测技术。与以往HPLC和低分辨质谱法相比，高分辨质谱法不仅定性准确、灵敏度高，而且只需一种检测器，分析速度快，有效提高了检测的准确性和效率，能够满足国内外对葡萄酒品质的有效监管和分析需要。

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