SRE元件报告质粒构建、转染和活性测定

张 弦， 王友平， 刘 璐， 刘 健

（合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）

在哺乳动物体内，固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）作为一种重要的转录因子，启动了下游脂质合成基因的表达，从而调控了胆固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成［1］。哺乳动物体内包括SREBP－1a、SREBP－1c、SREBP－2形式的SREBP。SREBP－1a和SREBP－1c主要参与脂肪酸的合成，而SREBP－2主要调控胆固醇合成相关基因和LDLR基因［2－6］。SREBP前体是在内质网中合成的，活化时前体裂解释放出成熟形式，成熟的SREBP转运到细胞核中与靶基因固醇调节元件（SRE）结合，从而增强其表达，进而导致脂质合成的增加［7－8］。该过程受到一系列相关活性物质（如固醇类物质）的严格调控。当细胞内固醇水平低时，SRBEPs裂解激活蛋白 （SREBPs－cleacageactivating protein，简称SCAP），运送SREBP到高尔基体中进行装配，由2个水解蛋白S1P（site 1protease）和S2P（site 2protease）进行裂解，释放出成熟的SREBP，转运到细胞核中激活目的基因。而当固醇水平较高时，胆固醇和氧化固醇（如25－羟基胆固醇）刺激SCAP和Insig蛋白（insulin－sensitive protein）结 合，导 致 SCAPSREBP复合物在内质网中滞留，进而降低成熟的SREBP，导致脂质合成基因表达的降低。

由于调节脂质合成的SREBP靶标是SRE元件，因此可以通过检测SRE元件的活性，评价相关活性调节物质对SREBP活性的影响，预测其对脂质代谢的作用［9－10］。本文扩增或人工合成了人LDLr基因启动子区域SRE元件1次重复片段或3次重复片段，将之插入荧光素酶报告基因载体pGL3－basic中，构建了2种含有人SRE元件的荧光素酶报告质粒。将这些质粒分别转染到人肝癌细胞 HepG2中［11－12］，通过具有显著增强作用的胰岛素［9］、明显抑制作用的胆固醇和25－羟基胆固醇［10］验证了所构建报告质粒的活性。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

pGL3－basic载体和双荧光素酶报告质粒检测试剂盒购自Promega公司；pRLTK质粒本实验室保藏；HepG2购自北京协和细胞资源中心；血液基因组提取试剂盒购自康为世纪生物公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自上海生工公司；FBS、opti－MEM和DMEM购自Gibco公司；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司。限制性内切酶、DNA连接酶和LA Taq酶购自TaKaRa公司。

1.2 方 法

1.2.1 SRE元件1次重复片段引物设计

利用PrimePrimer5.0软件设计扩增人的LDLr启动子的引物如下：

其中，上游引物中加入KpnⅠ的酶切位点，下游引物中加入XhoⅠ的酶切位点。PCR扩增人LDLr（－699～＋45）启动子片段，长度为744bp。

1.2.2 人SRE元件目的片段的合成

按照血液基因组提取试剂盒的说明书提取人血液基因组DNA。以人基因组DNA为模板，利用设计的上下游引物扩增含有SRE元件的LDLr启动子DNA序列。反应体系为LA Taq酶0.15μL、2×GC Buffer12.5mL、dNTP 2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、DNA模板1μL、双蒸水7.35μL。PCR循环条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min［13］。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

人工合成的SRE 3次重复序列［6］如下：

在该序列两端加入KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点。

1.2.3 荧光素酶重组质粒的构建和鉴定

所扩增的LDLr启动子区域PCR产物、人工合成的SRE 3次重复序列和pGL3－basic载体，使用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后，用T4DNA连接酶进行连接。连接产物转化感受态JM109，挑取阳性克隆菌落扩大培养。PCR验证阳性菌落，按照无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒DNA抽提，－20℃储存备用。

1.2.4 细胞的培养与瞬时转染

HepG2细胞在37℃5%CO2培养箱中进行培养。细胞培养基为含10%胎牛血清的DMEM，每2天更换1次培养基，细胞融合时用0.25%的胰酶进行消化传代，接种到96孔板备用。

将细胞接到96孔细胞培养板上24h，细胞密度达到融合时，使用无血清无双抗的DMEM处理过夜。按照每孔加入50μL含有0.25μg pGL3质粒DNA、0.05μg pRLTK质粒DNA和0.75μL脂质体的opti－MEM进行转染6h。转染后，加入无血清无双抗DMEM，恢复过夜。然后，加入胰岛素10μg／mL或25－羟基胆固醇2.5μmol／L和胆固醇25μmol／L，处理24h后，进行荧光素酶活性检测。

1.2.5 荧光素酶活性检测

除去培养基，用1×PBS清洗细胞。然后按推荐体积每孔加入1×PLB 20μL到96孔板中，放在细胞震荡仪上震荡裂解15min。将所得细胞裂解液移入酶标板中，加入LARII 100μL。混匀后，采用Thermo Scientific Fluoroskan Ascent荧光和化学发光检测仪检测。其后，加入等体积的1×Stop ＆Glo Buffer混匀，再检测。荧光素酶相对活性由第1次测得pGL3荧光活性和第2次测得pRLTK荧光活性的比值表示。

1.2.6 统计学处理

所有数据以均数标准差表示。由SPSS13.0统计软件，进行不同组之间的t检验，双侧P＜0.05为统计学意义的显著差异。

2 结果与讨论

2.1 人SRE片段的结构设计

参照人LDLr基因启动子序列，本文设计了2种含有SRE元件的报告基因：① 含有SRE 1次重复的LDLr启动子荧光素酶报告质粒（pGL3－basic－SRE1）；② 人工合成的SRE 3次重复的荧光素酶报告质粒（pGL3－basic－SRE3）。具体质粒结构示意图如图1所示。

图1 SRE的荧光素酶报告基因结构示意图

2.2 人SRE元件报告质粒的构建

本文从人的血液中提取并获得了约23kbp的人血液基因组DNA如图2所示。图2中，M代表λDNA／HindⅢMarker，1代表人血液基因组DNA。PCR扩增了含有SRE元件的LDLr启动子片段（－699～＋45），长度为744bp，如图3a所示。所得人LDLr启动子SRE 1次重复序列和人工合成的SRE 3次重复序列，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后，分别 插 入 pGL3－basic 载 体。pGL3－basic－SRE1 经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切和PCR验证后，再经测序验证，如图3所示。pGL3－basic－SRE3经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，再进行测序验证。图3中，M代表200bp DNA Marker；图3a中1代表PCR扩增LDLR启动子序列产物，2代表验证引物PCR检测空载体结果，3代表pGL3－basic－SRE1PCR验证结果；图3b中1和2分别代表pGL3－basic－SPE1和pGL3－basic－SRE3双酶切产物。

图2 人血液基因组DNA

图3 PCR扩增LDLr启动子和人SRE元件报告质粒电泳图

2.3 人SRE元件荧光素酶报告质粒活性的测定

本文检测了SRE元件荧光素酶报告质粒的基础转录活性，如图4所示。由图4可看出，在转染到 HepG2细胞后，pGL3－basic－SRE1和pGL3－basic－SRE3活性均比空载体pGL3－basic的活性有显著提高，说明在HepG2细胞中，SRE元件的报告质粒具有较高的转录活性。

图4 pGL3－basic－SRE1和pGL3－basic－SRE3的转录活性

胰岛素对SRE元件有激活作用［9］，而25－羟基胆固醇与胆固醇结合能抑制SRE元件活性［10］。因此，本文检测了胰岛素和25－羟基胆固醇／胆固醇对SRE元件荧光素酶报告质粒活性的影响，如图5和图6所示。

图5 胰岛素和25－OH／CHO对SRE1活性的影响

结果表明，10μg／mL胰岛素处理，活化了2种SRE元件的活性；而2.5μmol／L 25－羟基胆固醇和25μmol／L胆固醇结合处理，抑制了SRE元件的活性。在上述2项处理中，处理试剂对pGL3－basic－SRE1 的 作 用 均 比 对 pGL3－basic－SRE3的作用更强烈。

图6 胰岛素和25－OH／CHO对SRE3活性的影响

3 结 论

SREBP通过与靶基因SRE元件结合来调节胆固醇和脂质合成。因此，可以通过检测一些活性物质对SRE元件的应答来初步判断该物质是否影响脂质合成，进而预测SREBP相关活性物质的作用机制［10］。报告质粒在研究中经常被用在测定启动子对基因表达的影响［13］。其一般步骤包括：① 将目的基因调控序列或效应元件克隆并插入含报告基因的质粒中；② 将重组质粒转染到细胞系；③ 测定报告基因的表达水平，从而评价在调控序列指导下对靶基因表达可能的诱导作用。

本文通过克隆和人工合成了人LDLr启动子SRE 1次重复序列和SRE 3次重复序列，将其分别插入pGL3－basic vector载体中，构建了pGL3－basic－SRE1和 pGL3－basic－SRE3荧光 素 酶 报 告质粒，将其分别转染到人肝癌细胞HepG2中进行检测［11－12］。胰岛素处理显著活化SRE元件，而25－羟基胆固醇和胆固醇结合处理显著抑制SRE元件的活性，说明本文所构建的SRE元件报告质粒具有活性，能成功地反映SREBP活性的改变。胰岛素、25－羟基胆固醇与胆固醇结合对pGL3－basic－SRE1的效应作用都比对pGL3－basic－SRE3的作用强。这是因为REBP对SRE元件的效应作用可能也需要其他元件的参与，而不仅是与SRE元件的单独作用［4］。

［1］ Goldstein J L，DeBose－Boyd R A，Brown M S.Protein sensors for membrane sterols［J］.Cell，2006，124（1）：35－46.

［2］ Horton J D，Goldstein J L，Brown M S.SREBPs：activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver［J］.J Clin Invest，2002，109（9）：1125－1131.

［3］ Horton J D，Shah N A，Warrington J A，et al.Combined analysis of oligonucleotide microarray data from transgenic and knockout mice identifies direct SREBP target genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（21）：12027－12032.

［4］ Amemiya－Kudo M，Shimano H，Hasty A H，et al.Transcriptional activities of nuclear SREBP－1a，－1c，and－2to different target promoters of lipogenic and cholesterogenic genes［J］.J Lipid Res，2002，43（8）：1220－1235.

［5］ Briggs M R，Yokoyama C，Wang X，et al.Nuclear protein that binds sterol regulatory element of low density lipoprotein receptor promoter，I：Identification of the protein and delineation of its target nucleotide sequence［J］.J Biol Chem，1993，268（19）：14490－14496.

［6］ Liu J W，Ahlborn T E，Briggs M R，et al.Identification of a novel sterol－independent regulatory element in the human low density lipoprotein receptor promoter［J］.J Biol Chem，2002，275（7）：5214－5221.

［7］ Matsuda M，Korn B S，Hammer R E，et al.SREBP cleavageactivating protein（SCAP）is required for increased lipid synthesis in liver induced by cholesterol deprivation and insulin elevation［J］.Genes Dev，2001，15（10）：1206－1216.

［8］ Brown M S，Goldstein J L.The SREBP pathway：regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membranebound transcription factor［J］.Cell，1997，89（3）：331－340.

［9］ Tang J J，Li J G，Qi W.Inhibition of SREBP by a small molecule，betulin，improves hyperlipidemia and insulin resistance and reduces atherosclerotic plaques［J］.Cell Metabolism，2011，13（1）：44－56.

［10］ Yang L H，Chen T M，Yu S T，et al.Olanzapine induces SREBP－1－related adipogenesis in 3T3－L1cells［J］.Pharmacological Research，2007，56（3）：202－208.

［11］ 陶千山，罗 欣，柴 瑜，等.人白介素－15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建［J］.中国生化药物杂志，2011，32（3）：187－190.

［12］ 欧阳华伟，谭 军，李高峰，等.小鼠I L－10启动子荧光素酶报告基因的构建［J］.实用预防医学，2011，18（12）：2252－2253.

［13］ 邱娜莎，刘 畅，严雅静，等.家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达［J］.合肥工业大学学报：自然科学版，2012，35（8）：1117－1121.