人脐带血间充质干细胞对人胃癌MGC80-3 细胞增殖的影响

张 娜

邢台医学高等专科学校诊断教研室，河北 邢台054000

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)存在于机体多种组织中，可在体外进行培养扩增［1］，并参与肿瘤的发生、发展。目前多数研究主要针对MSCs对肿瘤的影响，人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs)在胃癌中的研究却少有报道。本文通过分析hUCB-MSC在体外对胃癌细胞增殖的影响，以期对胃癌的治疗提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 hUCB-MSCs，天津昂赛公司提供;人胃癌细胞株MGC80-3，河北医科大学第四医院科研中心提供，且在含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中生长，并在37 ℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养。

1.2 主要试剂 RPMI-1640、α-DMEM 细胞培养基，美国GIBCO 公司生产;四甲基偶氮唑蓝(MTT)，美国SIGMA 公司生产。

1.3 hUCB-MSCs 原代培养、纯化及表型鉴定 在含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 μl/ml 的α-DMEM 培养基在37 ℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养hUCB-MSCs。以5 000/cm2接种，达90%融合时胰酶消化传代。hUCB-MSCs 培养至第4 代，采用流式细胞仪对其进行表型鉴定。

1.4 MGC80-3 细胞培养 将含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/ml 的RPMI-1640 培养基在37 ℃，5% CO2和饱和湿度条件下培养人胃癌MGC80-3 细胞。以10 000/cm2接种，达50%融合时更换培养基，达90%融合时胰酶消化传代。待细胞生长状态佳，呈对数生长期时收集细胞用于实验。收集细胞后用PBS液洗涤2 次，备用。

1.5 MTT 法测定细胞增殖反应 取对数期人胃癌MGC80-3 细胞，以每孔1 ×104个细胞接种于96 孔板中，补足培养液至200 μl，将96 孔板放入CO2恒温培养箱，24 h 细胞贴壁后吸出培养液。实验组换用含不同浓度的MSC-CM，每个浓度做5 个复孔，置于CO2恒温培养箱分别培养24 h、48 h、72 h，培养结束前4 h，加入0.5% MTT 20 μl，37 ℃继续孵育4 h，终止培养。小心弃去孔内上清。每孔加入浓度为10%的DMSO 150 μl，振荡10 min。在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸光度值(OD)，检测波长492 nm，参考波长620 nm。按公式计算细胞抑制率。上述实验重复3 次。抑制率(%)= (1 - 实验组OD 值/对照组OD 值)×100%。

1.6 倒置相差显微镜观察hMSC-CMs 对MGC80-3细胞形态的影响 取对数生长期的MGC80-3 细胞，调整其浓度为5 ×105个/ml，在6 孔培养板的每孔中加入细胞悬液2 ml，待细胞贴壁良好后，向实验孔中加入浓度为75%的hMSC-CMs，继续培养72 h，于倒置相差显微镜下观察结果。

1.7 流式细胞仪测定人胃癌MGC80-3 细胞凋亡用Rnase 酶消化已固定的人胃癌MGC80-3 细胞。在4 ℃条件下加入溴化丙啶(PI)1 ml 染色30 min，以500 目铜网过滤，制备待检测的单细胞悬液。调整仪器的变异参数(CV)在2%以内，激发光源为15 mW 氩离子激光器，激发波长为488 mm。计算细胞凋亡百分率。

1.8 统计学分析 运用SPSS 13.0 统计学软件对实验数据进行处理，计量资料以x ±s 的形式表示。多组间均数差异性的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hUCB-MSCs 的表型鉴定 采用流式细胞仪表型分析获得的第4 代hUCB-MSCs 细胞表达情况为:高表达PE-CD73(97. 69%)、PE-CD90(100%)、PE-CD105(96. 59%);低表达FITC-CD19(0. 50%)、FITC-CD34(0.23%)、PE-CD11b(0.20%)、PE-CD45 (0.11%);对组织相容性表型分析显示:低表达HLA-DR(0.07%)、PE-IgG(1.00%)、FITC-IgG(0.17%)。上述结果说明细胞均质性好，符合本实验要求(见图1)。

图1 流式细胞仪检测细胞表型结果Fig 1 Phenotype of MSCs by flow cytometry

2.2 MTT 比色法分析结果 MTT 比色法分析浓度分别为25%、50%、75%、100%的MSC-CM 对MGC80-3 细胞增殖的作用，以不含MSC-CM 组作为空白对照组。结果显示:MSC-CM 在25% ～100%浓度范围内对MGC80-3 细胞增殖具有较明显的抑制作用，存在剂量-效应和时间-效应关系。不同浓度的MSC-CM 作用MGC80-3 细胞24 h、48 h、72 h 后，各实验组抑制率均有不同程度升高，与空白对照组相比，差异均有统计学意义(P ＜0.05)。抑制率以100%MSC-CM 作用72 h最高，达到(67.695 ±14.444)% (见图2、表1)。

图2 细胞抑制率的组间比较Fig 2 Comparison of inhibitory rates among groups

表1 MSC-CM 对MGC80-3 细胞增殖的影响(x±s)Tab 1 Effect of MSC-CM on the proliferation of MGC80-3 cells (x±s)

2.3 流式细胞仪测定细胞凋亡情况 MGC80-3 细胞与浓度依次为0、25%、50%、75%MSC-CM 共培养72 h后，流式细胞仪可测得典型的亚二倍体凋亡峰，说明MSC-CM 能诱导MGC80-3 细胞发生凋亡，细胞凋亡率随着MSC-CM 浓度的升高而升高。各实验组与空白对照组比较及各实验组之间比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05，见图3 ～4、表2)。

图3 细胞凋亡百分率的组间比较Fig 3 Comparison of apoptotic rate among groups

2.4 倒置相差显微镜观察结果 对照组细胞生长良好，贴壁紧密，细胞呈片状融合，呈梭形，形态饱满;而75%浓度的MSC-CM 作用72 h 后的细胞出现贴壁不良，细胞密度降低，细胞固缩为圆形或卵圆形(见图5)。

图4 不同浓度的MSC-CM 对MGC80-3 细胞作用72 h 后测得的凋亡峰 A:对照组;B:25%浓度组;C:50%浓度组;D:75%浓度组Fig 4 Apoptotic rates of MGC80-3 cells treated by MSC-CM for 72 h with different concentration A. control group;B.25% concentration group;C. 50% concentration group;D.75%concentration group

图5 作用72 h 后MGC80-3 细胞在倒置相差显微镜下的表现(100 ×) A:对照组;B:75%浓度组Fig 5 Expression of MGC80-3 cells untreated with MSC-CM for 72 hours by inverted phase contrast microscopy (100 ×) A:control group;B:75% concentrotion group

3 讨论

目前多数研究主要针对骨髓来源MSCs，但骨髓取材困难，供者难以接受，来源受到限制。相比较而言，hUCB-MSC 不仅保持了MSCs 的生物学特性，而且还具备如下优点:hUCB-MSC 更原始，增殖分化能力更强;免疫原性低，一般不引起免疫反应;分离培养操作简便，易于工业化生产;冷冻后可多次使用，且冷冻造成的细胞损伤小;潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低;取材方便，对产妇、新生儿无任何损伤及危害;易于保存、运输;无道德、伦理学的限制。本研究应用流式细胞术对所使用的hUCB-MSC 进行免疫表型和基因表型鉴定，证实hUCB-MSC 与其他来源的MSC 类似，高表达CD10、CD13、CD29、CD44、CD51、CD73、CD90、CD105 等;低表达或不表达CD14、CD33、CD34、CD45、CD56、HLA-G、HLA-DP、HLA-DQ、HLADR 等［2］。结果表明所使用的4 ～8 代hUCB-MSC 具备MSC 各项特征，符合实验要求。

本实验通过MTT 比色法研究脐带血来源间充质干细胞-条件培养基(the condition medium of MSCs，MSC-CM)在不同浓度范围内对人胃癌MGC80-3 细胞增殖的作用，结果发现:不同浓度MSC-CM 作用于MGC80-3 细胞24 h、48 h、72 h 后，各实验组抑制率均有不同程度升高，与空白对照组相比，差异均有统计学意义(P ＜0.05)，且有剂量-效应和时间-效应关系。随着MSC-CM 浓度的提高、作用时间的延长，其对MGC80-3 细胞增殖的抑制率逐渐升高。通过诱导肿瘤细胞凋亡可起到抑制肿瘤细胞生长的作用，而肿瘤细胞的形态学变化是评价诱导凋亡作用最简便、最直观的指标。本实验通过倒置相差显微镜观察发现对照组细胞生长良好，贴壁紧密，细胞呈片状融合，呈梭形，形态饱满;而75%MSC-CM 作用72 h 后的细胞出现贴壁不良，细胞密度降低，细胞固缩为圆形或卵圆形。进一步通过流式细胞技术进行凋亡率检测发现MGC80-3 细胞与浓度依次为0、25%、50%、75%MSC-CM 共培养72 h 后，流式细胞仪可测得典型的亚二倍体凋亡峰，说明MSC-CM 能诱导MGC80-3 细胞发生凋亡，且随MSC-CM 浓度的增大而逐渐增高，MSC-CM 通过诱导MGC80-3 细胞凋亡进而发挥抑制MGC80-3 细胞生长的作用。

Lu 等［3］通过体外实验得出MSCs 可促进淋巴瘤细胞(YAC-1、EL-4)、肝癌细胞H22 等凋亡，抑制上述肿瘤细胞生长。Cho 等［4］发现MSCs 通过影响血管生成因子、趋化因子配体8、胰岛素样生长因子结合等的表达水平，使卵巢癌SK-OV-3 细胞核发生固缩，进而抑制肿瘤细胞的生长。在Ohlsson 等［5］进行的一项动物实验研究中，将结肠癌细胞和MSCs 的混合物与基质共同接种到大鼠皮下，MSCs 和结肠癌细胞数相等时，结肠癌细胞的生长完全被抑制。本研究结果显示，hUCB-MSC 能明显抑制人胃癌细胞株MGC80-3 细胞的体外增殖与转移，且作用效果具有剂量和时间依赖性。

已有研究表明MSCs 抑制肿瘤细胞生长的机制可能与以下因素有关:(1)MSCs 通过降低Akt 信号通路中丝氨酸苏氨酸激酶活性、促进肿瘤细胞产生p21、诱导肿瘤细胞产生凋亡促进因子caspase-3 等机制直接抑制肿瘤细胞生长［3，6-7］。(2)通过分泌血管生成素-1(Ang-1)抑制肿瘤血管的渗漏和体内肿瘤生长［8］，释放Wnt 通路抑制因子DKK-1［9］等旁分泌机制发挥抑制作用。(3)作为抗原提呈细胞产生CD8+T 淋巴细胞依赖的抗肿瘤免疫反应［10］。

基于目前多项实验研究所得，结合本实验研究结果，认为hUCB-MSC 对胃癌细胞的增殖起抑制作用，深入研究其作用机制有可能对胃癌的临床治疗提供一定的依据。

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