24份西番莲种质SSR分子标记分析

应东山　张如莲　王明　王琴飞++高玲++刘迪发++李莉萍

摘 要 采用SSR标记对24份西番莲材料的遗传多样性进行研究，从45对引物组合中筛选出16对扩增带清晰、重复性好的引物组合。结果表明：16对SSR引物共产生68条扩增带，其中58条为多态性条带，多态性条带比率平均为85.3 %，24份材料的遗传相似系数（GS）的范围为0.09-1.0；UPGMA法聚类分析结果表明，24份西番莲种质以0.45为阈值可分为7大类，SSR标记丰富的多态性可在西番莲分子生物学领域中广泛应用。

关键词 西番莲 ；SSR ；种质资源 ；遗传多样性

中图分类号 Q949.759.5

西番莲别名鸡蛋果、百香果，是西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora Linn）热带多年生草质到半木质藤本攀缘果树，广泛分布于热带、亚热带地区。西番莲富含17种氨基酸，具有柠檬、柑、桔、橙子、菠萝等水果香味，素有“饮料之王”、“水果味精”的美称，是生产果汁饮料的重要原料和添加剂。南美洲安第斯山脉地区被认为是西番莲属遗传多样性中心，拥有450多个种，尽管其中只有少数可食且具有香味的西番莲被开发和商业化[1]。其中在中国有19种，当前作为果实供食用的主要有6个种：紫果种（Passiflora edulis Sims）、黄果种（P. edulis Sim. F， flavicarpa Deg.）、樟叶西番莲（P. laurifolia L.）、大果西番莲（P.quadrangularis L.）、甜果西番莲（P. ligularis Juss）、香蕉西番莲（P. mollissima （HBK））等6类[2]。

分子标记的应用和发展在西番莲商业化品种选育上具有重要的作用，分子标记能直接从DNA水平反映种质之间的遗传差异，也是研究植物遗传多样性的有效工具。西番莲属自交不亲和，因此通过西番莲群体的基因流研究可解释种群间的遗传多样性[1]。目前，利用SSR标记对国内西番莲种质遗传多样性研究方面鲜有报道，尚缺乏较系统、有针对性地对不同产地的西番莲资源进行分子水平上的遗传评价与鉴定分类。本实验采用SSR标记分析西番莲遗传多样性，SSR标记数量众多，属于共显性遗传，具高度多态性、重复性和稳定性，简便可靠，因此被广泛地用于遗传多样性研究。它们丰富且均匀地分布在整个基因组中[3-4]，这使得它们适合于系谱关系的研究[5]。目前，SSR标记已经广泛地应用遗传图谱构建、基因定位和克隆、基因组结构、起源进化研究、分子标记辅助育种等方面。本研究以24份西番莲种质为材料，在前期体系优化的基础上，利用SSR分子标记技术研究西番莲资源的遗传多样性，以期为西番莲种质资源的分类、育种和资源的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验采用的西番莲叶片取自中国科学院西双版纳热带植物园（采集地简称勐腊）、云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所（采集地简称保山）、中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心（采集地简称儋州）西莲种质圃，详见表1。

实验所用Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、标准分子量DNA（100 bp plus Marker）购自TaKaRa公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2）。电泳所用主要试剂甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、去离子甲酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺等均为国产分析纯。

1.2 方法

西番莲总DNA提取参考Kit等[6]的改良CTAB法，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，将DNA浓度稀释至20 ng/μL。利用已开发的45对SSR引物，筛选出扩增多态性好、条带清晰的16对引物，对24份材料进行扩增。

PCR反应体系为20 μL，其中包括0.2 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、60 ng DNA模板、0.5 μmol/L引物及10×PCR buffer（含Mg2+）。PCR进行扩增的程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52-62 ℃（根据具体引物的退火温度而定）复性1.0 min，72 ℃延伸1.0 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用8 % PAGE胶进行检测，PAGE胶经30 min预电泳，之后加入经变性剂变性后的产物4.0 μL进行点样，75 W恒功率电泳1 h，电泳结束后银染检测。

1.3 数据分析

选择重复性好、清晰可辨的照片进行谱带统计，依据SSR扩增图谱中同一位置上电泳条带的有无统计建立二元矩阵表，每个引物迁移率相同的条带记为1个位点，有条带的赋值为1，无条带的赋值为0，构建SSR的0、1数据库。

按照Nei等[7]的方法计算材料间的相似系数，并利用GS值按类平均法进行遗传相似性聚类分析和构建聚类图。应用NTSYSpc-2.10版软件，计算24份西番莲种质间遗传距离或遗传相似系数，然后根据非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建亲缘关系聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

从45对引物组合中筛选出16对扩增带清晰、重复性好的引物组合，分别对24份材料的DNA进行PCR 扩增，16对引物共产生68条扩增带，其中58条为多态性条带，多态性条带比率平均为85.3 %。

2.2 聚类分析

24份西番莲资源以0.45为阈值，可分为7个类群，第Ⅰ类群包括2份种质，来自农业部质检中心儋州基地的樟叶西番莲、Danzhou 1号；第Ⅱ类群包括1份种质，来自儋州农业部质检中心基地的双花西番莲；第Ⅲ类群包括1份种质，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的Passiflora yucatanesic；第Ⅳ类群包括15份种质，其中来自儋州农业部质检中心基地的有9份，包括Danzhou 2号、Danzhou 3号（黄果）、Danzhou 4号（紫红果）、Danzhou 5号、Danzhou 6号（黄果）、Danzhou 7号、Danzhou 8号、Danzhou 9号、紫果西番莲，表明分子标记不能区分种质的果实颜色；来自云南农科院热经所保山种质圃的有3份，包括紫果西番莲、黄果西番莲、泰国种；来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的有3份，包括澳A、澳B、Passiflora edulis（紫果）；第Ⅴ类群包括2份种质，P.Coccinea和Passiflora coccinea，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃；第Ⅵ类群包括1份种质为Passiflora faetida，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃；第Ⅶ类群包括2份种质，大果西番莲和Passiflora guadrangularis（大果西番莲），分别来自云南农科院热经所保山种质圃和中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃（图1）。

3 讨论与结论

西番莲变异系数大，可用于一些重要农艺性状的、定位的天然杂交群体[1]。开展西番莲基因流、迁移率和有效群体大小的预测对了解国内西番莲自然群体活力和物种生殖系统的研究很重要。Diana等[8]利用AFLP、SSR对来自哥伦比亚的70份材料进行种内变异研究；Juliana等[9]利用ISSR标记评估改良和未经改良的黄果西番莲遗传变异研究；Cerqueira-Silva1等[10]利用16条RAPD引物区分14种基因型西番莲种质；Eileen等[11]利用7条RAPD引物和SSR A08FP1引物对供观赏用的3个新品种西番莲杂种进行确认，扩增得到杂合西番莲种属特异性片段。冷言峰[12]利用14条ISSR引物对33份西番莲种质进行遗传多样性分析，多态位点比率为99.56 %，说明西番莲种质资源存在广泛的遗传变异，这与本研究结果相一致。

Danzhou 1号西番莲叶片的叶形与樟叶西番莲相似，叶革质、卵状长圆形、基部圆形、全缘、无毛、叶脉羽状，与樟叶西番莲的相似性系数为0.78，故其亲缘关系较近。其中双花西番莲单独聚为一类，在叶形、果实大小方面与黄果、紫果西番莲相比有较大的差异，其结果在分子与形态学上有着一定程度的一致性。

大多数供试的西番莲材料的亲缘关系较远，遗传相似性系数为0.09-1.0，可能由于西番莲属异花授粉植物，长期的开放授粉使不同基因型间基因频繁交流，使得种质之间存在一定的差异。种质间的遗传差异与材料采集地的关系不太明显，来自云南勐腊的澳A、澳B和来自云南保山的紫果、黄果、泰国种与来自海南儋州的大部分聚为一类，这与冷言峰[12]的研究结果一致。但来自儋州地区的Danzhou 2号、Danzhou 3号、Danzhou 4号、Danzhou 5号、Danzhou 6号、Danzhou 7号、Danzhou 8号、Danzhou 9号、紫果西番莲等大多数西番莲聚为一类，这也表明目前儋州地区西番莲种质资源的遗传基础较为狭窄。其可能是该地区引进的品种较为单一；也可能是育种者为保持其亲本的的优良性状，采用无性繁殖的方式，而推广优良无性系是西番莲繁殖的主要途径，使得在这些种质的某些性状的基因趋于一致，从而导致后代亲缘关系多数较近；还有以实生选种为主的育种过程，也是同一地区种质的遗传关系趋向于一致。在国内西番莲的研究还处于初级阶段，地域之间的种质交流不频繁也是导致这一结果形成的原因。

本研究结果还发现黄果西番莲和紫果西番莲聚为一类，在分子上不能按果实颜色来区分种质。其原因在于西番莲种质之间的亲缘关系近，这跟国内的一些育种现状相吻合，黄果西番莲是紫果西番莲的突变种，其亲缘关系较近，如‘占果1号、‘古杨1号均是从黄、紫果种杂交后代中选出的优良品系[13]。

来自云南农科院热经所保山种质圃的大果西番莲与中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的Passiflora guadrangularis（大果西番莲）两者聚为一类，表明大果西番莲与其他品种西番莲的差异较大，分子标记能完全将大果种西番莲与其他品种的西番莲区分开来。来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃P. coccinea、Passiflora coccinea聚为一类，相似性系数为0.83，亲缘关系很近，可能为同一品种的不同突变株。来自儋州的紫果西番莲与来自勐腊的Passiflora edulis（紫果）相似性系数为1，可能为同一个品种材料。

参考文献

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