桦褐孔菌提取物体外抗氧化活性评价研究

马思慧，程萍，方研，王萍

（东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040）

桦褐孔菌［Inonotusobliques（Fr.）Pilát］是来自西伯利亚原始森林中的药用真菌，具有预防心血管疾病、神经细胞衰老、癌症、糖尿病等疾病的功效［1-5］。这些功能的发挥与其抗氧化活性密不可分。因此相关领域的研究主要集中在其抗氧化活性，但对于其提取物中哪种物质的抗氧化性较好鲜有报道。鉴于此，本实验通过对不同溶剂的提取物体外抗氧化活性的评价，分析各活性物质含量与抗氧化指标的相关性，确定高效抗氧化活性成分，为以后对桦褐孔菌的进一步利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桦褐孔菌，黑龙江省哈尔滨市东北林副特产专营店；DPPH，Sigma Aldrich公司；总抗氧化能力检测试剂盒（FRAP法），碧云天生物技术研究所；2-硫代巴比妥酸，上海源叶生物科技有限公司；2-脱氧-D-核糖，上海拜力生物科技有限公司；槲皮素标准品，中国药品生物制品检定所。

1.2 仪器与设备

722 型可见光分光光度计 上海光谱仪器有限公司；JA2003型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；TGL-16G高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；SHB-B循环水式真空泵 郑州长城科工贸公司；DG3022型酶标仪 华东电子管厂。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

取桦褐孔菌粉碎，过80目筛。装入密封袋备用。

1.3.2 桦褐孔菌有效成分的提取

分别称取12份2.0g桦褐孔菌粉末于磨口锥形瓶中，按料液比1∶50分别加入水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇、20%丙酮、40%丙酮、60%丙酮、80%丙酮、100%丙酮和异丙醇，50℃ 水 浴 提 取 2h。3500r／min 离 心 分 离10min，收集上清液。将残渣按照相同的方法再提取一次。将每次收集的上清液在45℃条件下旋蒸浓缩，冷藏备用。

1.3.3 多糖含量的测定

1.3.3.1 标准曲线的绘制

参照Dubois，M.，Gilles，KA［6］等人的实验方法，采用苯酚-硫酸比色法，准确称取0.1000g葡萄糖，用蒸馏水定容至1000mL葡萄糖质量浓度为0.1g／L密量取该溶液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL管中，蒸馏水定容至1mL摇匀。再加入5%苯酚试剂0.6mL振荡，再加入3.6mL迅速振荡摇匀，于室温放置30min后在490nm处测定吸光度。以葡萄糖的浓度（C）W为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程y＝8.8471x-0.0049，相关系数 R2＝0.9983。

1.3.3.2 多糖含量的测定［7］

将不同溶剂提取的桦褐孔菌粗提物用蒸馏水定容至100mL分别准确吸取1mL于25mL管中稀释成相应的倍数（m）。吸取样品液1.0mL，置干燥具塞试管中，按标准曲线绘制步骤加入苯酚和浓硫酸溶液，测吸光度，以标准曲线计算这1.0mL样品中多糖含量（f）［8］，用公式计算多糖含量＝m×f×100

1.3.4 总酚含量的测定

1.3.4.1 标准曲线的绘制［9］

准确称取没食子酸0.025μg，加蒸馏水定容至100mL。精密量取该溶液0.0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mL，分别置于25mL容量瓶中，用蒸馏水定容。分别加入1mL福林酚试剂，混匀，4min后加入2mL 7.5% 碳酸钠溶液，45℃水浴15min，于765nm处测定吸光值。以没食子酸的浓度（C）W为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程y＝0.0047x＋0.0047，相关系数R2＝0.9961。

1.3.4.2 总酚含量的测定［10］

将不同溶剂提取的桦褐孔菌粗提物用蒸馏水定容至100mL，分别准确吸取1mL于25mL试管中稀释成相应的倍数（m）。吸取样品液1.0mL，置干燥具塞试管中，按标准曲线绘制步骤测吸光度，以标准曲线计算这1.0mL样品中总酚含量（f），用公式计算总酚含量＝m×f×100。

1.3.5 黄酮含量的测定

1.3.5.1 标准曲线的绘制［11］

准确称取槲皮素0.002g，加95%乙醇定容至20mL。分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL至10mL容量瓶中，用95%乙醇定容。分别转入试管中加2%的氯化铝2mL，室温下反应30min。于360nm下读吸光值。以槲皮素的浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程y＝2.1926x-0.0012，相关系数 R2＝0.9992。

1.3.5.2 黄酮含量的测定含量测定［12］

将不同溶剂粗提物用蒸馏水定容至100mL，分别准确吸取1mL于25mL试管中稀释成相应的倍数（m）。分别准确吸取1mL，置干燥具塞试管中，按标准曲线绘制步骤加入2%的氯化铝2mL，95%乙醇定容至10mL，室温下反应30min，于360nm下读吸光值。以标准曲线计算这1.0mL样品中黄酮含量（f）［13］，用公式计算黄酮含量＝m×f×100。

1.3.6 粗提物抗氧化性的测定

1.3.6.1 清除 DPPH·能力［14］

准确称取6.2mg DPPH，用无水乙醇溶解定容至100mL，各取4mL不同溶剂提取的样品溶液和该溶剂加入2mL 1×10-4mol／L DPPH标准溶液于比色试管中，迅速混匀，避光反应30min后在517nm下测定吸光度，同时用水进行空白试验。每个样品平行进行3次，用以下公式计算清除率（K）［15］。

式中，Ai：4mL样品溶液＋2mL DPPH溶液的吸光值；Aj：4mL提取溶剂＋2mL DPPH溶液的吸光值；Ac：4mL水＋2mLDPPH溶液的吸光值。

1.3.6.2 总还原力FRAP

标准曲线测定的准备［16］：称取27.8mg本试剂盒提供的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1mL，此时浓度即为100mmol／L。取适量100mmol／L FeSO4溶液用蒸馏水稀释至0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50mmol／L。

总抗氧化能力的测定［17］：在96孔板的每个检测孔中加入180μL FRAP工作液。在空白对照孔中加入5μL蒸馏水；标准曲线检测孔内加入5μL各种浓度的FeSO4标准溶液，样品检测孔内加入5μL各种样品，轻轻混匀，于37℃孵育3～5min后测定593nm处吸光值。

1.4 数据处理

用SPSS软件对粗提物中多糖、总酚、黄酮含量和各抗氧化指标进行相关性分析。

2 结果与分析

图1 不同溶剂的多糖含量

2.1 不同溶剂提取物中多糖的含量

图1可知，桦褐孔菌提取物中多糖含量随提取溶剂不同而不同。其中，40%乙醇提取物的多糖含量最多，为64.2mg／g；100%丙酮提取物含量最少，为1.87mg／g。不同溶剂提取物物中多糖含量的大小顺序为：40%乙醇＞20%乙醇＞60%乙醇＞水＞20%丙酮＞80%乙醇＞60%丙酮＞80%丙酮＞无水乙醇＞异丙醇＞正丁醇＞100%丙酮。

2.2 不同溶剂提取物中总酚的含量

图2 不同溶剂的多酚含量

由图2可知，桦褐孔菌提取物中多酚含量随提取溶剂不同而有所变化。其中，20%丙酮提取物中多酚含量最多，为55.26mg／g；正丁醇提取物中多酚含量最少，为0.95mg／g。按照提取物中多酚含量由多到少的顺序排序，为20%丙酮＞60%丙酮＞40%丙酮＞60%乙醇＞40%乙醇＞80%丙酮＞20%乙醇＞80%乙醇＞水＞无水乙醇＞异丙醇＞100%丙酮＞正丁醇。

2.3 不同溶剂提取物中黄酮的含量

由图3可知，桦褐孔菌提取物中黄酮含量随提取溶剂不同而有所变化。其中，20%丙酮提取物中黄酮含量最多，为15.12mg／g；正丁醇提取物中黄酮含量最少，为0.067mg／g。按照各溶剂提取物中黄酮含量的多少排序，为20%丙酮＞40%乙醇＞20%乙醇＞60%乙醇＞40%丙酮＞水＞60%丙酮＞80%乙醇＞80%丙酮＞无水乙醇＞丙酮＞异丙醇＞正丁醇。

图3 不同溶剂的黄酮含量

2.4 不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除能力

图4 不同溶剂提取物对DPPH·的清除能力

DPPH·是一种稳定的有机自由基，通过检测桦褐孔菌粗提物对DPPH·的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。由图4可知，不同溶剂提取物对DPPH·的清除能力不同。其中，60%乙醇提取物清除率最大，为0.75；正丁醇提取物对DPPH·的清除能力最小，为0.10。各溶剂对DPPH·的清除能力大小顺序为：60%乙醇＞80%乙醇＞60%丙酮＞20%乙醇＞40%乙醇＞80%丙酮＞水，40%丙酮＞20%丙酮＞无水乙醇＞异丙醇＞100%丙酮＞正丁醇。

2.5 不同溶剂提取物总还原能力的测定（FRAP法）

图5 不同溶剂提取物FRAP值

由图5可知，不同溶剂提取物的FRAP值不同。其中60%乙醇提取物的FRAP值最大，为11.03；异丙醇提取物的FRAP值最小，为1.22。各溶剂提取物的FRAP值大小顺序为：60%乙醇＞60%丙酮＞40%乙醇＞40%丙酮＞20%乙醇＞水＞80%丙酮＞20%丙酮＞80%乙醇＞无水乙醇＞丙酮＞正丁醇＞异丙醇。

2.6 相关性分析结果

表1 相关性分析结果

由表1可知，多糖含量和DPPH·清除率、FRAP值呈显著性相关，其相关性系数分别为0.851和0.706，均大于多酚含量、黄酮含量与二个抗氧化指标的相关性系数。

3 结论

不同溶剂提取物中多糖含量范围是1.87～64.2mg／g；多酚含量范围是0.95～55.26mg／g；，黄酮含量范围是0.067～15.12mg／g。不同溶剂提取物清除DPPH·的清除率范围是0.10～0.75，FRAP值的范围是1.22～11.03。且多糖含量与各抗氧化指标的相关性最大，说明桦褐孔菌多糖在其抗氧化性中发挥主要作用。本研究对于开发具有清除人体自由基的产品具有重要意义。

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