5°海红果酒发酵工艺的优化*

杨辉，党翠红

(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安，710021)

海红果(Malus micromalus Makino)，学名西府海棠，蔷薇科苹果属，又名海红子，是我国晋、陕、蒙三省交界地带特有的一种地方果树资源，营养价值丰富，富含蛋白质、VC、16种氨基酸、多种矿质元素，其中赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等人体必需氨基酸含量是红星苹果的2.2倍，有“果中钙王”之美誉，磷含量居水果之首，Fe、Zn等金属元素含量也高于其他常见水果［1］。此外，海红果中富含的黄酮、多酚类化合物更是赋予其降血脂、降血压、抗肿瘤、抗氧化等保健功效［2-4］。

本研究针对海红果含糖量高的特点将其直接发酵生产低度果酒(乙醇体积分数为1% ～7%［5］)，不仅能发挥发酵酒特有的保健作用，而且能充分利用海红果资源，发挥其保健功效，同时，低度果酒的研制避免了高酒精度对人体的不良影响，扩大了消费人群［6-9］。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

浓缩海红果汁:由陕西府谷县聚金邦农产品开发公司提供。

活性干酵母:VL1、VL2由陕西府谷县聚金邦农产品开发公司提供;RV100、RV171购于安琪酵母股份有限公司;丹宝利购于广东丹宝利酵母有限公司。皂土、白砂糖(食品级)、H2SO3(6%，分析纯)、柠檬酸(分析纯)、Na2CO3(分析纯)、CaCO3(分析纯)，市售。

1.2 仪器与设备

振荡培养箱，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;pH计，成都市方舟科技开发公司;手持糖度计，成都光学仪器厂;磁力搅拌器，江苏省金坛市正基仪器有限公司;高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 指标测定

理化指标的测定参考GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。总糖:费林试剂法;酒精度:密度瓶法;总酸:电位滴定法;挥发酸(以乙酸计):滴定法;游离SO2:氧化法;干浸出物:密度瓶法。

感官指标:参照GB/T15038-2006制定甜型海红果酒评分标准，由20名专业人员组成的感官评定小组进行评定，取其感官评定分数的平均值作为评定结果，感官评分标准见表1。

1.3.2 工艺流程及要点

1.3.2.1 工艺流程

表1 甜型海红果酒感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of sweet Malus micromalus Makino wine

1.3.2.2 操作要点

前处理:根据糖度每降低17 g/L，乙醇体积分数升高1%计算，要生产5°的甜型海红果酒(糖度≥50 g/L)，稀释后海红果汁的初始糖度必须≥135 g/L。将调整成分后的海红果汁进行巴氏杀菌处理(68℃、30 min)，冷却后向海红果汁加入60 mg/L的SO2以抑制杂菌及野生酵母生长。

活性干酵母的活化:称取所需量的活性干酵母，加入20 mL左右的待发酵海红果汁，在37℃水浴中活化30 min，再加入少量待发酵海红果汁降温，直至温度下降到与待发酵海红果汁温差在5℃以内即可搅拌接种。

终止发酵:接种酵母后定时测定发酵酒液的总糖含量，当监测到总糖含量减少量为85 g/L(乙醇体积分数为5%左右)时，测定发酵酒液的酒精度并立刻终止发酵，终止发酵采用冷冻离心分离酵母后加入60 mg/L的SO2的方法，离心的条件为4 000 r/min，10 min。

海红果原酒的澄清:称取10 g皂土，缓缓加入100 mL 50℃左右的蒸馏水中，浸泡24 h，再搅拌成均匀的浆体，制备成5%的皂土溶液，再将其在水浴中加热至80℃，冷却备用。皂土溶液的添加量为1%。

1.3.3 酵母筛选

调整海红果汁可溶性固形物含量为20°Brix(费林法测得总糖含量为159.18 g/L)，此时，总酸含量为12.57 g/L，以0.02%的接种量分别接种 VL1、VL2、RV100、RV171、丹宝利活性干酵母，在自然 pH条件下进行发酵，控制发酵温度20℃，终止发酵后经过后处理制得5°海红果酒，综合比较各种酵母的起酵时间，最终成品酒的总酸含量、挥发酸含量以及感官评定分数，选出最适宜酿造5°海红果酒的酵母。

1.3.4 影响海红果酒发酵效果的单因素试验

1.3.4.1 发酵温度对发酵效果的影响

调整海红果汁可溶性固形物含量为20°Brix(费林法测得总糖含量为158.28 g/L)，此时，总酸含量为12.07 g/L，在果汁自然pH条件下以0.02%的接种量接种5度海红果酒最适酵母进行发酵，控制发酵温度为 12、16、20、24、28℃，监测发酵酒液的总糖含量变化，终止发酵及后处理后，探讨发酵温度对5°海红果酒发酵效果的影响。

1.3.4.2 酵母接种量对发酵效果的影响

将海红果汁可溶性固形物含量调整为20°Brix(费林法测得总糖含量为157.17 g/L)，此时，总酸含量为12.62 g/L，在果汁自然pH条件下分别以0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的接种量接种酵母，控制发酵温度20℃，终止发酵及后处理后，探讨酵母接种量对果酒发酵的影响。

1.3.4.3 初始糖度对发酵效果的影响

用海红果浓缩汁、白砂糖将海红果汁可溶性固形物含量分别调整为 18、20、22、24、26°Brix(费林法测得总糖含量分别为 141.12、163.72、187.85、205.92、231.55 g/L)，此时，总酸含量为12.02 g/L，在果汁自然pH条件下以0.02%的接种量接种5度海红果酒最适酵母，控制发酵温度20℃，终止发酵及后处理后，探讨初始糖度对发酵效果的影响。

1.3.4.4 初始pH对发酵效果的影响

将海红果汁可溶性固形物含量调整为20°Brix(费林法测得总糖含量为154.79 g/L)，用柠檬酸、Na2CO3将果汁的初始pH分别调整为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5，并用柠檬酸、CaCO3调整初始pH至3.5作为对照，此时，总酸含量分别为36.47、15.19、10.62、8.94、6.58、11.27 g/L，均以 0.02%的接种量接种 5度海红果酒最适酵母，控制发酵温度20℃，终止发酵及后处理后，探讨初始pH对5度海红果酒发酵效果的影响。

1.3.5 响应面法优化5度海红果酒发酵工艺

在单因素试验的基础上，选取发酵温度(A)、酵母接种量(B)、初始糖度(C)、初始pH(D)为响应面优化的考察因素，并以-1、0、1分别代表因素的水平，由于将乙醇体积分数统一控制在5%，故以成品酒的感官评定分数为响应值，设计4因素3水平的响应面分析试验，试验因素及水平表见表2。

表2 Box-Behnken试验因素水平表Table 2 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

2 结果与分析

2.1 酵母种类对发酵效果的影响

由于海红果汁的初始pH较低，为2.9左右，低pH会抑制酵母菌的生长，因此表3显示5种酵母的起酵时间均较长。相对而言，VL1最短，其次为VL2;5种酵母从开始发酵产酒到总糖含量下降85 g/L(乙醇体积分数5%)所需的时间均为3～4d，因此，酵母的起酵时间决定了整个发酵周期的长短。不同的酵母由于产生的挥发性化合物种类、含量不同而给酒带来不同的感官特征［10］。由于海红果果实中含酸较高，制成的海红果酒口感偏酸，因此在发酵过程中尽量选择产酸较少的酵母种类，由表3可以看出最后制得的成品酒的总酸、挥发酸含量最低的是VL2，其次为安琪RV171，而且VL2和安琪RV171酿造的5°海红果酒感官评定分数也相对较高，分别为84.31和86.75，综合考虑起酵时间、成品酒的总酸含量、挥发酸含量及感官评定分数，确定VL2为最适合酿造5°海红果酒的酵母。

表3 酵母种类对5°海红果酒发酵的影响Table 3 Effect of yeast type on 5%(v/v)Malus micromalus Makino wine fermentation

2.2 影响海红果酒发酵效果的单因素试验结果

2.2.1 发酵温度对发酵效果的影响

由表4可知发酵温度越高，酵母的起酵时间越短，这是由于在一定温度范围内，发酵温度越高，酵母的生长速率和酶活力越高［11］。但是发酵温度过高果酒的口感粗糙，而且酵母会产生其他代谢副产物如甲醇等，发酵温度过低时，酵母菌受温度胁迫而发酵缓慢，引起挥发酸升高，综合比较成品酒的总酸、挥发酸含量和感官评定分数，发酵温度为20℃时，总酸、挥发酸含量较低，感官评定分数最高，因此初步确定20℃为较适宜的发酵温度。

表4 发酵温度对5°海红果酒发酵的影响Table 4 Effect of fermentation temperature on 5%(v/v)Malus micromalus Makino wine fermentation

2.2.2 酵母接种量对发酵效果的影响

由表5可以看出，酵母接种量越大，起酵时间越短。接种量过小，酵母自身繁殖代谢慢，易污染杂菌，导致酒质不协调。但是接种量过大时，发酵过于迅速，增大了5°酒终止发酵的难度，且造成了原料的浪费。接种量为0.02%～0.04%时起酵时间相差较小，因此将接种量范围初步确定在0.02% ～0.04%。而感官评定分数随着接种量的增大呈现先增大后降低的趋势，接种量为0.03%时感官评定分数最高，且总酸、挥发酸含量相对较低，因此初步确定活性干酵母的接种量为0.03%。

表5 酵母接种量对5°海红果酒发酵的影响Table 5 Effect of inoculum size of yeast on 5%(v/v)Malus micromalus Makino wine fermentation

2.2.3 初始糖度对发酵效果的影响

由表6可以看出初始糖度越高，起酵时间越长，原因在于含糖量过高，形成了发酵酒液的高渗透，降低酵母的活性。随着糖度的增加，总酸含量降低;挥发酸含量增加，这是由于高糖条件下酵母菌受高渗透压胁迫发生不完全发酵形成醋酸，因此为了控制较低的挥发酸含量，初始糖度不能过高。随着糖度的增加，感官评定分数先上升后下降，原因在于最终的成品乙醇体积分数统一在5%左右，即按照糖度与酒精度的换算公式整个发酵过程消耗的总糖量均为85 g/L左右，因此初始糖度越高，最终成品酒的残糖也相应越高，糖酸比逐渐变大，使酒的口感过甜而偏腻，残糖低则口感偏酸。另外，由于本研究控制海红果酒的乙醇体积分数为5%，不能用传统的添加酒精的方法终止发酵［12］，因此，当发酵酒液乙醇体积分数达到5%时，高残糖必将增大终止发酵的难度，并且不利于成品酒的保存。因此，综合考虑起酵时间、口感、保存期限等因素，将海红果汁的初始糖度确定为20°Brix。

表6 初始糖度对5°海红果酒发酵的影响Table 6 Effect of initial sugar concentration on 5%(v/v)Malus mrcromalus Makino wine fermentation

2.2.4 初始pH对发酵效果的影响

pH值对酵母菌的生长繁殖和代谢产物的合成都有极大的影响，大多数种类的酵母菌在4.5～6.5的pH范围内生长代谢良好［11］。由表7可以看出初始pH越高起酵时间越短，且初始pH≥3.5时，酵母的起酵时间均较短，约24h左右。初始pH越高，成品酒总酸含量越低，适当的酸度会赋予酒独特的酸爽口感，酸度过低，会使酒的口感腻而平淡［13］。且随着初始pH增大，挥发酸含量先下降后上升，原因在于发酵液pH高于4.0或低于3.1时，都易于促进挥发酸的生成;感官评定分数先上升后下降，用CaCO3调整初始pH为3.5时，成品酒的挥发酸含量最低，但是CaCO3的加入对酒的口感和酒质的负面影响较大，感官评定分数低。在pH值为3.5时，成品酒感官评定分数最高，挥发酸含量较低，总酸含量适中，且与果汁自然pH值2.9相对接近，利于保证海红果酒的风格。因此初步确定用Na2CO3调整初始pH为3.5，为较适合的条件。

表7 初始pH对5度海红果酒发酵的影响Table 7 Effect of initial pH on 5%(v/v)Malus mrcromalus Makino wine fermentation

2.3 响应面法优化果酒发酵工艺

2.3.1 模型的建立与显著性检验

在单因素试验的基础上根据Box-Behnken中心组合设计原理进行响应面试验，试验结果见表8。

表8 Box-Behnken试验设计方案及结果Table 8 Experimental design and results of Box-Behnken central composite design

通过Design Expert7.0软件对试验响应值进行二元回归拟合分析，确立回归方程模型为:Y=86.42+0.69A-0.39B-0.017C+0.23D-0.25AB-0.075AC-0.075BD-0.075CD-1.14A2-1.07B2-0.43C2-0.056D2。回归模型的方差分析见表9。

表9 回归模型方差分析Table 9 Analsis of variance for the regression model

根据方程系数的估计，可知各因素对响应值影响的主次顺序为A(发酵温度)＞B(酵母接种量)＞D(初始pH)＞C(初始糖度)。

2.3.2 优化工艺条件的确定

根据所建立的数学模型进行参数的最优化分析，得出5°海红果酒发酵的最优条件为发酵温度20.67℃、酵母接种量0.027%、初始糖度19.86°Brix、初始pH 3.7。考虑实际操作性，将发酵工艺参数修正为:发酵温度21℃、酵母接种量0.027%、初始糖度20°Brix、初始 pH 3.7。

2.3.3 验证性试验

在优化条件下，成品酒的感官评定分数预测值为86.30。为检验试验结果的可靠性，采用上述优化条件进行3组平行验证性实验，其实验结果为86.15、86.20、86.15，平均值为 86.17，因此，采用响应面法优化5度海红果酒发酵工艺参数准确可靠，具有一定的实用价值。

2.3.4 产品感官指标与理化指标

感官指标:5°海红果酒色泽呈浅红棕色，澄清透明，果香浓郁，口感醇厚协调，具有典型的甜型酒风格。

主要理化指标:乙醇体积分数为4.90% ～5.10%;总酸10～12 g/L(以酒石酸计);总糖68.3～71.7 g/L;游离SO2＜50 mg/L;干浸出物39.6 g/L。

微生物指标:符合GB2758-2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》的规定。

3 结论

(1)VL2是酿造5°海红果酒的最适酵母。

(2)响应面法优化5°海红果酒最优工艺条件为:发酵温度21℃、酵母接种量0.027%、初始糖度20°Brix、初始pH 3.7，在此条件下，成品酒的感官评定分数为86.17。所得果酒果香浓郁、酒香协调，是一种营养丰富的低度保健型果酒。

(致谢 感谢榆林市海红果工程技术研究中心的对本文大力支持。)

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