香蕉皮单宁的提取及其提取物的抑菌抗氧化活性*

王虹玲，武婷茹，姜诗文，刘丹丹，司锐，杨玉红

(沈阳工学院生命工程学院，辽宁抚顺，113122)

香蕉为我国南方四大果品之一，属于高热量水果，营养价值颇高，且产量很大。长期以来，对于香蕉人们只食其果肉，而对于果皮未有充分的开发利用。研究表明，香蕉皮占香蕉全果重量的35% ～41%［1］，其中含有大量的果胶、膳食纤维、蛋白质、脂肪及多种微量元素［2］;此外，香蕉皮中含有的活性抑菌成分——单宁还可有效地治疗由细菌和真菌感染所引起的皮肤瘙痒症［3］。因此充分开发香蕉皮资源，既可以实现资源的循环利用，保护环境，又可以创造额外的经济价值。目前对于香蕉皮中果胶［4-7］、多糖［8-9］、膳食纤维［10-12］等营养物质提取的研究较多，但是对于单宁的提取却鲜有报道。

单宁又称鞣质、单宁酸，是多酚中高度聚合的化合物，化学性质活泼。研究表明单宁在紫外线区有强吸收值，能高效吸收空气中的紫外线，抑制过氧化氢酶的活性，还原皮肤中沉积的黑色素从而起到防晒美白的效果［13］;此外，单宁还可以通过抑制皮肤中弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解能力恢复皮肤弹性，延缓机体衰老，促进细胞代谢，增强皮肤活力，起到抗皱的功能［14］。近年来又因其具有抗氧化、捕捉自由基、抑菌、衍生化反应等生物活性，而被广泛地应用于食品加工、果蔬加工、贮藏、医药和水处理等领域［15］，开发前景十分广阔。

本研究以市售新鲜香蕉为原料，通过响应面分析法优化香蕉皮单宁的微波提取工艺条件，并对单宁提取物进行了抑菌和抗氧化活性研究。

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 材料

市售进口香蕉，购于抚顺市农贸市场。

1.1.2 供试菌种

细菌为大肠杆菌，金黄色葡萄球菌;霉菌为根霉菌，青霉菌;酵母菌为啤酒酵母，以上菌种均为本实验室保存菌种。

1.1.3 培养基

细菌、霉菌、酵母菌分别采用LB、PDA和YPD培养基培养。

1.2 试验试剂

无水乙醇、丙酮、甲醇、H3PO4、HCl、H3PO4·12MoO3、Na2WO4、单宁酸、H2O2、Fe2SO4、FeCl3、Tris-HCl缓冲液、邻苯三酚、邻二氮菲、HCl等，均为国产或进口分析纯。

1.3 仪器设备

LD210-2R型电子天平(美国 Sartorius公司)，721G型可见分光光度计(日本岛津公司)，SW-CJ-2FD型超净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，WF-2000微波提取器(上海宁商超声仪器有限公司)，FW100型高速万能粉碎机(成都广谱科学仪器有限公司)，GFL-70型鼓风干燥箱(上海越众仪器设备有限公司)，LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器(杭州科博仪器有限公司)，HPX-9052MBE型电热恒温培养箱(苏州江东精密仪器有限公司)，RE-52A型旋转蒸发仪(上海洪纪仪器设备有限公司)等。

1.4 实验方法

1.4.1 样品预处理

将新鲜香蕉皮清洗去杂后放入鼓风干燥箱中，105℃杀青灭酶处理15min，然后在65℃条件下恒温烘干至恒重，最后将干燥后的香蕉皮放入高速万能粉碎机中粉碎，过40目筛，收集香蕉皮粉密封备用。

1.4.2 项目测定

1.4.2.1 F-D 试剂的配制［16］

F-D试剂配制:准确称取 Na2WO4100 g、H3PO4·12MoO320 g、H3PO450 mL，溶于 750 mL 蒸馏水中，水浴回流2 h，待溶液冷却后加蒸馏水稀释至1 L备用。

1.4.2.2 单宁酸标准曲线的绘制

称取单宁酸5 mg，加水溶解并定容至50 mL，得到浓度为0.1 mg/mL的单宁酸标准液。准确吸取标准液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和 4.5 mL于10个50mL容量瓶中，分别加入2.5 mL F-D试剂和5 mL饱和碳Na2CO3溶液，定容且混合均匀，静置30 min后以第一个容量瓶中的溶液为空白对照，于650 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(Y)，浓度(μg/mg)为横坐标(X)，得到的标准曲线方程:Y=0.089 8 X-0.002 1;R2=0.999 7。

1.4.2.3 单宁的提取及含量测定［17］

将处理后的香蕉皮粉准确称取1.0 g置于锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇提取溶剂，于一定微波功率和料液比条件下，在微波提取器中提取一定时间，反复提取3次，合并滤液，与标准曲线同法测吸光度，并根据标准曲线计算单宁提取量。

1.4.2.4 单宁总含量的测定及提取率计算

准确称取香蕉皮粉1.0 g，在乙醇体积分数70%、提取时间100 s、微波功率450 W、料液比1∶30(g∶mL)的条件下，进行反复提取，直到滤渣中加入1%的FeCl3不显绿色为止，分别计算出每次提取的单宁含量，并进行叠加，得出香蕉皮中单宁的总含量。通过测定香蕉皮中单宁的总含量为439.73 mg/g。

单宁提取率/%=(单宁提取量/单宁总含量)×100

1.4.3 响应面试验

根据单因素试验结果和Central Composite Design(CCD)设计原理，运用Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计，以单宁提取率为响应值，乙醇体积分数、提取时间、微波功率及料液比为考察因素，建立响应值与影响因素间的数学模型，优化香蕉皮单宁的最佳提取工艺。试验设计因素和水平见表1。

1.4.4 单宁抑菌效果测定

1.4.4.1 菌悬液的制备

将预先制备好的培养基灭菌后置于平皿内，待培养基凝固后接入相应菌种，细菌于37℃下恒温培养1 d，霉菌和酵母菌于28℃下恒温培养2 d，连续培养3次，取活化好的菌种用无菌生理盐水配制成浓度为108CFU/mL的菌悬液，备用。

1.4.4.2 抑菌性能的测定［18］

将滤纸用打孔器打成直径为6 mm的滤纸片，160℃干热灭菌2 h后放入单宁提取液中浸泡24 h，无菌水做对照。吸取制备好的菌悬液100 μL于相应的培养皿上，均匀涂布。用无菌镊子将上述滤纸片沥去多余液体后放入含菌平皿中，每皿2片，每种菌做3个重复，按相应条件培养。游标卡尺分别测量每个抑菌圈的两个垂直方向的直径(呈十字)，取平均值，判定其抑菌效果。

1.4.4.3 最低抑菌浓度(MIC)的测定［19］

将提取液浓缩后，配制浓度为50 mg/mL的溶液，依次倍比稀释得到8个浓度梯度的单宁溶液，各吸取2 mL置于平板内，之后加入预先制备好的培养基，充分混匀待其凝固后，吸取100 μL菌悬液于平板内，涂布均匀，放入相应条件下的恒温培养箱内培养一定时间，菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为提取液对该菌的MIC。每个受试样平行重复3次，以不含提取液的平板做对照。

1.4.4.4 防腐剂对照

将8个浓度的单宁溶液换成同样浓度的苯甲酸钠溶液且做相同处理，测定常用化学防腐剂苯甲酸钠对各菌种的MIC。

1.4.5 单宁抗氧化活性试验

1.4.5.1 香蕉皮单宁对超氧阴离子自由基的清除作用

采用邻苯三酚自氧化法［20］测定香蕉皮单宁对超氧阴离子自由基的清除作用。准确吸取不同浓度的待测样品液1mL，加入4.5 mL 0.1 mol/L的Tris-HCL缓冲液(pH 8.2)和0.3 mL于25℃条件下预热的5 mmol/L邻苯三酚溶液，混匀后于25℃条件下保温5 min，加10 mol/L的HCl溶液1 mL终止反应，320 nm波长处测定吸光值，记为Ai，空白对照以相同体积的去离子水代替样品，记为A0，每组试验重复3次，取平均值。以VC做阳性对照，同法操作。清除率计算公式为:

P/%=［(A0-Ai)/A0］×100

1.4.5.2 香蕉皮单宁对羟自由基的清除作用［21］

取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液1 mL，PBS缓冲液5 mL，0.75 mmol/L FeSO4溶液1 mL和2 mL不同浓度的样品溶液充分混匀后，加入1 mL 3%H2O2，于37℃水浴中反应60 min后，在536 nm处测定吸光度值，做3次平行试验，取平均值。以VC做阳性对照，同法操作。清除率(P)计算公式为:

P/%=［(A2-A0)/(A1-A0)］×100

式中:A0为不含样品的溶液的吸光值;A1为以蒸馏水代替H2O2的溶液的吸光值;A2为含有样品的溶液的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 响应面分析法优化香蕉皮单宁提取工艺

2.1.1 回归模型的建立及方差分析

根据单因素试验结果，选取单宁提取率为考察响应值，进行乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、微波功率(C)和料液比(D)4因素5水平的Central Composite Design(CCD)试验设计。响应面分析方案与结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6软件对表2试验数据进行多元回归拟合，获得以香蕉皮单宁提取率为响应值的回归方程:Y=87.41-1.70A+0.065B+0.73C+0.35D+0.35AB+0.21AC+1.39AD+2.63BC-2.29BD+0.52CD-1.54A2-5.12B2-1.59C2-2.52D2。

回归方程的方差分析结果显示(表3):回归模型极显著(P＜0.000 1)，失拟项不显著(P＞0.05)，回归模型的决定系数R2=0.970 1，调整系数，说明该模型与试验拟合较好，可以用于香蕉皮中单宁提取率的理论预测。从回归方程系数显著性检验可知，各因素对单宁提取率影响程度依次为:乙醇体积分数＞微波功率＞料液比＞提取时间;交互项AD、BC、BD 极显著(P ＜0.001);二次项 A2、B2、C2、D2均对单宁提取率有极显著的影响(P＜0.000 1)。

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Program and experimental results of RSM

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 ANOVA results of regression model

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Pro＞F 显著性CD 4.27 1 4.27 1.82 0.197 5 A2 65.04 1 65.04 27.67 ＜0.000 1 ＊＊B2 719.70 1 719.70 306.14 ＜0.000 1 ＊＊C2 69.55 1 69.55 29.59 ＜0.000 1 ＊＊D2 174.86 1 174.86 74.38 ＜0.000 1 ＊＊残差 35.26 15 2.35失拟项 24.26 10 2.43 1.10 0.487 0纯误差 11.01 5 2.20总和1 181.28 29

2.1.2 响应面分析及最佳提取工艺研究

香蕉皮单宁提取工艺优化的响应面及其等高线见图1。图1列出了自变量中交互作用极显著(P＜0.01)的3项AD、BC和BD。3组图形直观的反应了各因素对响应值的影响，在响应面图中，曲面越陡峭，则表示该因素对响应值的影响越显著。等高线图与响应面图相对应，越接近等高线图的中心，对应的响应值就越大，且等高线图形状接近椭圆形，表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。比较3组图形可知，乙醇体积分数和微波功率对香蕉皮单宁提取率影响较为显著，表现为曲线较陡峭;而提取时间和料液比次之，曲线较为平缓。同时，3组图形的交互作用也都是明显的，等高线趋于椭圆形。

图1 各因素交互效应对香蕉皮单宁提取率影响的曲面图Fig.1 Contour and surface plot of the combined effects of each factors on the tannin extraction from banana peel

图1-a表示乙醇体积分数和料液比及两者交互作用对香蕉皮单宁提取率的影响。从图1-a可以看出，当料液比保持不变时，乙醇体积分数过高不利用单宁的提取;当保持乙醇体积分数不变时，单宁提取率随料液比的提高呈现出先增加后降低的趋势。

图1-b为微波功率和提取时间及两者交互作用对单宁提取率的影响。当微波功率不变时，随提取时间的增大，香蕉皮单宁提取率先增大后减小;当提取时间不变时，随微波功率的增加，单宁提取率逐渐增大。

图1-c为料液比和提取时间的交互作用对香蕉皮单宁提取率的影响，从图1-c中等高线变化趋势可以随着料液比和提取时间的提高，单宁提取率呈现先升高后降低的明显趋势。

运用Design Expert 8.0.6的响应面分析软件对试验结果进行优化，得到香蕉皮单宁的最优提取条件:当乙醇浓度为74.29%、提取时间为80.67 s、微波功率372.88 W、料液比为1∶29.53、提取次数为3次时，香蕉皮单宁提取率预测可达到最大值87.97%。为实际操作方便，将上述最优提取条件简化为:乙醇体积分数75%、提取时间80 s、微波功率375 W、料液比1∶30，提取次数3次后进行3次重复试验，得到香蕉皮单宁提取率的平均值为87.04%，与预测值接近，说明了此响应面法优化得到的单宁的微波提取工艺在实践中可行。

2.2 抑菌性能测定

2.2.1 香蕉皮单宁的抑菌性能测定

通过问卷调查数据结果分析发现，北方农村住宅的取暖方式仍旧较为落后，使用传统能源比例较大，是冬季室内空气污染的主要来源；同时居民吸烟、房屋装修、冬季结霜等也成为了室内污染的重要来源。居民通风换气的次数低，主要依靠开窗通风的形式，单次开窗通风时间长，造成能源浪费，同时将室外污染物带入室内，从数据可以看出，北方农村地区通风换气现状并不理想，存在很大的改善空间。居民对于室内环境的不满意度较低，反映了居民对室内环境的关注程度较低，主动采取通风换气措施来改善居住环境的意识较差。

图2 香蕉皮单宁的抑菌试验结果Fig.2 Antibacterial activities of tannin from banana peel

本试验以细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)、真菌(酵母菌)和霉菌(青霉、根霉)为研究对象，考察了不同浓度香蕉皮单宁的抑菌性能，结果如图2所示。单宁浓度为0是空白对照，即培养基中不含单宁提取液，涂布等量的无菌水。空白组抑菌圈直径为6 mm，表示无抑菌效果，大于6 mm表示具有抑菌活性，抑菌圈直径越大，抑菌效果越明显。由图2可知，香蕉皮单宁对各种以上各种微生物均有明显的抑制作用，随着单宁浓度的降低，相应的抑菌圈直径也随之减小。其中，单宁对大肠杆菌的抑菌的抑菌效果最明显，对酵母菌的抑菌效果最差。表现出对于同一浓度的单宁提取液，大肠杆菌的抑菌圈直径最大，酵母菌最小。当单宁浓度较高时(＞25 mg/mL)，金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于霉菌，浓度较低时则对霉菌的抑制效果较好。

2.2.2 香蕉皮单宁最低抑菌浓度MIC的测定

采用稀释分析法分析香蕉皮单宁对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉、根霉和酵母菌的最低抑菌浓度(表4)，凡是最高稀释平板中无菌落形成者，即为单宁对该菌种的MIC。由实验结果可知，大肠杆菌的MIC为0.781 3 mg/mL，金黄色葡萄球菌和酵母菌为6.25 mg/mL，青霉和根霉为1.562 5 mg/mL，可见香蕉皮单宁对大肠杆菌的抑菌效果最好，酵母菌最差。这与滤纸片法进行香蕉皮单宁对各菌种的抑菌性能测定的结果相一致。

表4 香蕉皮单宁的最低抑菌浓度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of tannin from banana peel

2.2.3 苯甲酸钠MIC的测定

苯甲酸钠是食品中常用的化学防腐剂，测定不同浓度的苯甲酸钠对各种微生物的MIC，与香蕉皮单宁做对比，以此判定香蕉皮单宁替代化学防腐剂的可行性。苯甲酸钠对5种受试菌的抑菌情况见表5。由5可知，苯甲酸钠对各菌种均有不同程度抑菌作用，其中大肠杆菌的MIC为12.5 mg/mL，金黄色葡萄球菌为25 mg/mL，青霉和根霉为6.25 mg/mL，酵母菌的MIC为3.125 mg/mL。可见苯甲酸钠对酵母菌的抑制作用最明显，对细菌的抑制作用最弱，其次为霉菌。比较香蕉皮单宁和苯甲酸钠的对各菌种的MIC可知，与当前常用的化学防腐剂苯甲酸钠相比，香蕉皮单宁提取液对以上五种受试菌具有较强的生长抑制作用。鉴于化学防腐剂的毒副作用，和我国香蕉资源的丰富，开发天然的防腐剂用以替代化学防腐剂在食品中的应用具有广阔的应用前景。

表5 苯甲酸钠的最低抑菌浓度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of Sodium benzoate

2.3 香蕉皮单宁的抗氧化作用

2.3.1 香蕉皮单宁对超氧阴离子自由基的清除作用

通过图3显示，香蕉皮单宁提取物和Vc溶液均对超氧阴离子自由基有一定的清除能力，且清除率随浓度的增加而提高。低浓度时Vc对超氧阴离子自由基的清除效果低于单宁，但随浓度的增加至1.0 mg/mL后，Vc的清除效果急剧增加，在浓度为1.8 mg/mL时，Vc的清除率可达(85.12±2.872)%，单宁的清除率为(66.04±3.926)%。而单宁在低浓度时增加较快，当达到一个最佳浓度后趋于平缓，清除率变化不大，其中单宁提取液的最佳作用浓度为1.4 mg/mL。

2.3.2 香蕉皮单宁对羟自由基的清除作用

图3 不同浓度的抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除效果Fig.3 Scavenging capacities of antioxidants in different concentrations for superoxide anion free radicals

香蕉皮单宁和Vc对羟自由基的清除效果如图4所示。从图4可以看出，随着单宁和Vc质量浓度的增加，两者对羟自由基的清除率均呈上升趋势。其中低浓度时(＜1.4 mg/mL)，单宁对羟自由基的清除效果要优于Vc，但随着浓度的增加单宁清除率曲线趋于平缓，Vc对羟自由基清除率则随浓度的增加而迅速提高。当达到最大实验浓度1.8 mg/mL时，Vc的清除率为(92.23±3.172)%，单宁的清除率为(73.14±4.128)%。

图4 不同浓度的抗氧化剂对羟自由基的清除效果Fig.4 Scavenging capacities of antioxidants in different concentrations for hydroxyl free radicals

综上可知，香蕉皮单宁对超氧阴离子和羟自由基均具有较好的清除效果，表现出较强的抗氧化活性。超氧阴离子自由基和羟自由基是氧分子还原成水时产生的活性中间体，由于自由基中含未成对电子而具有高度的化学活性，可对生物体产生极大的损伤。单宁中的酚羟基可提供活泼的氢从而稳定自由基，进而终止自由基的链式反应［14］。从单宁的抗氧化结果中可以看出，单宁对超氧阴离子和羟自由基的清除具有一定的饱和效应，即随浓度的增大，清除率趋于平缓，此结果与张纵圆和顾海峰等人的研究相一致［23-25］。这可能是由于单宁易氧化的特性，随浓度的增加，单宁自氧化作用与抗氧化作用达到平衡，从而限制了其清除活性氧的能力。

3 结论

本研究在单因素试验基础上，采用CCD试验设计及响应面分析，建立了香蕉皮单宁提取的二次多项回归模型，确定单宁提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数75%、提取时间为80 s、微波功率375 W、料液比为1∶30、提取次数3次，在此条件下单宁的提取率为87.04%。

香蕉皮中的单宁具有一定的抑菌活性，且对大肠杆菌的抑制效果最为明显，依次为霉菌和酵母菌。最低抑菌浓度试验结果表明，大肠杆菌的MIC为0.781 3 mg/mL，金黄色葡萄球菌和酵母菌为6.25 mg/mL，青霉和根霉为1.562 5 mg/mL，与单宁抑菌活性试验结果相一致。同时，通过与常用的化学防腐剂苯甲酸钠的MIC对比可知，香蕉皮单宁在对细菌和霉菌的抑菌效果方面要优于苯甲酸钠。

香蕉皮单宁还可以有效的清除超氧阴离子自由基和羟自由基，且在低浓度时表现出优于Vc的清除能力;在浓度为1.8 mg/mL时，单宁对超氧阴离子和羟自由基的清除率可达(66.04±3.926)%和(73.14±4.128)%，具有较强的抗氧化性能。

我国香蕉资源丰富，香蕉皮中单宁含量较高且具有较强的抑菌和抗氧化性能，有效的利用香蕉皮资源，充分发挥的单宁的抑菌和抗氧化功能，研制出天然的防腐剂和抗氧化剂，在资源紧缺和人们健康意识不断提高的今天具有非常重要的研究意义和应用价值。

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