高效液相色谱-串联质谱法测定比格犬血浆中的莫诺苷浓度及其药代动力学

熊 山， 李敬来， 朱秀清， 王晓英， 吕圭源， 张振清＊

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州310053；2.军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850）

莫诺苷（结构见图1）是从中药山茱萸（Cornus officinalis Sieb.＆Zucc.）中提取分离获得的环烯醚萜苷类化合物［1］。研究表明，山茱萸环烯醚萜苷具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗肿瘤等，并对心血管系统和神经系统有一定的保护作用。其中，莫诺苷能抑制过氧化诱导的神经细胞损伤，促进人神经上皮瘤细胞（SH-SY5Y）的生长，并提高局灶性脑缺血再灌注大鼠皮层总抗氧化能力，对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有一定的神经保护作用［2-4］。

图1 莫诺苷的化学结构Fig.1 Chemical structure of morroniside

在药效学实验的基础上，前期已经应用液相色谱-电喷雾串联质谱法（LC-MS／MS）建立了大鼠血浆中莫诺苷的血药浓度测定方法，并进行了莫诺苷大鼠体内的药代动力学及组织分布研究。结果显示，大鼠单剂量灌胃给药20 mg／kg，计算得到的主要药代动力学参数：AUC（0-∞）为（587.6±290.7）μg／L·h，Cmax为（334.2±148.0）μg／L，Tmax为（0.6±0.3）h，t1／2为（0.7±0.3）h［5］。在大鼠组织分布研究中，大鼠单剂量灌胃给药30 mg／kg后，莫诺苷在大鼠体内的吸收和分布较快，药物入血后在体内各个组织分布较为广泛，大部分组织均在45 min达到药物浓度最高值；药物在组织中的消除也比较快，6 h后药物在组织中基本消除完毕［6］。

本研究在前期研究的基础上，采用LC-MS／MS技术建立了比格犬血浆中莫诺苷的检测方法，优化了色谱及质谱的各项条件，进行了系统的方法学验证，并应用于药代动力学研究，以探讨莫诺苷在比格犬体内的变化规律。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

莫诺苷（HPLC 测定纯度大于98.5%）由首都医科大学宣武医院药物研究所提供；芍药苷对照品（批号：110736-201035，纯度：96.5%）购自中国食品药品检定研究院；色谱纯乙腈和甲醇购自美国Fisher Scientific公司；分析纯甲酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；水为纯净水。

1.2 仪器与软件

API 5000 三重四极杆串联质谱系统，Analyst 1.5.2质谱数据处理软件（美国AB公司）；Shimadzu LC-20AD 二 元 泵，SIL-20AHT 自 动 进 样 器，CTO-20A 柱温箱（日本岛津公司）；XW-80A 旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；Denver T-214电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；高速低温离心机（美国Thermo Scientific公司）；DAS 2.0软件（由皖南医学院孙瑞元和郑青山教授主编）。

1.3 实验动物

比格犬5只，雄性，体重（10±2）kg，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（军）2007-004。

1.4 LC-MS／MS条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP柱（50 mm×2.1 mm，5μm）；流动相：水（含1 mmol／L 甲酸钠，A），乙腈（B）；梯度洗脱：0～0.5 min，5%B～20%B；0.5～1.0 min，20%B～70%B；1.0～3.0 min，70%B～95%B；3.0～3.2 min，95%B～5%B；3.2～6 min，5%B；流速：0.4 mL／min；进样量：10μL；柱温：20 ℃；分析时间：6 min。

1.4.2 质谱条件

检测离子对分别选择：m／z 429.1→267.3（莫诺苷），m／z 503.4→341.2（芍药苷），两个化合物的检测离子均选择［M＋Na］＋峰。电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）；莫诺苷与内标芍药苷的离子源电压（IS）：5 kV；源温度（TEM）：550 ℃；气帘气（CUR）流速：25 L／h；碰撞气（CAD）流速：12 L／min；锥孔气流速（Gas1）：45 L／min；去溶剂气流速（Gas2）：45 L／min；去簇电压（DP）：180 V；入口电压（EP）：10 V；碰撞能（CE）：35 V；碰撞池出口电压（CXP）：15 V。

1.5 血浆样品处理

取待测比格犬血浆50μL，加入50μL纯净水，混匀，再分别加入100μL芍药苷溶液（500μg／L）和150μL 甲醇，充分振荡1 min 后，以14 000 r／min离心10 min，取上清液进样10μL。

2 结果

2.1 特异性

空白比格犬血浆、比格犬血浆加标样品和比格犬灌胃后1 h的典型色谱图见图2。莫诺苷和内标芍药苷的保留时间分别为1.96和2.06 min，峰形良好，血浆中内源性物质不干扰莫诺苷和内标的测定。

2.2 标准曲线与定量限

用纯净水将莫诺苷储备液稀释成质量浓度为2、10、50、400、2 000 和5 000μg／L 的 系 列 标 准 溶液，取空白比格犬血浆50μL加入50μL 标准溶液混匀，其他操作同1.5 节所述，LC-MS／MS 方法测定。质控样品的制备、处理及测定同上，标准液的浓度分别为5、200 和4 000μg／L（低、中、高3 种 浓度）。采用加权最小二乘法计算标准曲线方程，以莫诺苷与内标的峰面积比值为Y，以莫诺苷的质量浓度为X，得 到 的 回 归 方 程 为Y ＝0.003 86 X ＋0.014 6（n＝5），权重因子W ＝1／X2，相关系数r＝0.996 6。相对标准偏差（RSD）均在《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》（2005年）规定范围之内。定量限为2μg／L。

图2 （a）空白犬血浆样品、（b）空白犬血浆加标（莫诺苷2μg／L和内标）样品及（c）灌胃莫诺苷（15 mg／kg）后比格犬血浆样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of（a）blank beagle plasma，（b）blank beagle plasma spiked with morroniside（2μg／L）and internal standard and（c）a beagle plasma sample after intragastric（ig）administration of a 15 mg／kg dose of morroniside

2.3 精密度与准确度

用空白比格犬血浆配制低、中、高3个浓度（同质控样品）的样品各5份，连续测定3 d，用随行标准曲线计算相应的药物浓度，分别考察批内和批间精密度与准确度。实验结果表明，低、中、高3个浓度的批内和批间RSD 均小于12%，准确度为89%～111%，结果见表1。

2.4 提取回收率和基质效应

提取回收率为空白血浆中加入药物经提取后的药物响应值与空白血浆处理后加入相同量药物响应值的比值；基质效应为具有基质的标准品与纯标准品的目标化合物的响应强度的比值。实验样品为质控样品（n＝3）。莫诺苷在低、中、高3个浓度的提取回收率 分 别 为（78.65±1.77）%、（83.33±1.14）%、（88.59±1.82）%，回收率符合要求且稳定；基质效应分别为（100.06±5.64）%、（94.92±0.77）%、（83.40±1.89）%，因此可忽略基质效应的影响。

表1 比格犬血浆中莫诺苷测定方法的精密度和准确度（n＝5）Table 1 Precision and accuracy of the assay method for morroniside in the beagle plasma（n＝5）

2.5 稳定性考察

配制莫诺苷低、中、高3个浓度（5、200和4 000 μg／L）的比格犬血浆样品（同质控样品，n＝5）。室温放置6 h后，低、中、高3个浓度对应的测定结果分别为（4.99±0.32）μg／L、（210.20±6.61）μg／L、（3 562.00±132.55）μg／L；上清液样本在自动进样器中存放24 h后，对应的测定结果分别为（5.06±0.38）μg／L、（214.40±7.30）μg／L、（3 718.00±135.54）μg／L；莫诺苷血浆样本冷冻20 d后，对应的测定结果分别为（4.98±0.40）μg／L、（189.20±6.30）μg／L、（3 548.00±133.30）μg／L。结 果 表明，在上述稳定性考察条件下，莫诺苷各浓度的测定值与实际值相近，准确度高，表明莫诺苷在上述贮存及测定过程中均是稳定的。

2.6 莫诺苷在比格犬体内的药代动力学研究［7］

按照莫诺苷5、15和45 mg／kg的给药剂量单次给予比格犬灌胃给药。

将5只比格犬编号并称重，分3个周期分别给予3个剂量的药物，清洗期为1周，自由饮水。于给药前禁食12 h，自由饮水。于给药前及给药后5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h由腿静脉分别取血1 mL，于3 000 r／min离心15 min，将血浆于-30 ℃下保存备用。

比格犬单次灌胃给予莫诺苷后的平均血药浓度-时间曲线见图3；将动物种属、给药剂量、给药方式和测得的血药浓度等信息输入DAS2.0软件，处理后得到主要药代动力学参数见表2。对药-时曲线下的面积AUC（0-∞）和剂量进行线性回归，回归方程为Y＝216.11 X＋632.78（Y：AUC（0-∞），μg／L·h；X：剂量，mg／kg），相关系数r 为0.999 7，说明比格犬灌胃莫诺苷后，呈线性药代动力学过程。

表2 比格犬灌胃3个剂量莫诺苷后的主要动力学参数（mean±SD，n＝5）Table 2 Pharmacokinetic parameters of morroniside after ig administration of three level doses in beagles（mean±SD，n＝5）

图3 比格犬单次灌胃莫诺苷的平均血药浓度-时间曲线（mean±SD，n＝5）Fig.3 Mean concentration-time curves of morroniside after single ig administration in beagles（mean±SD，n＝5）

3 结论

本研究运用LC-MS／MS联用技术建立了比格犬血浆中莫诺苷血药浓度的检测方法，该方法简便、特异性强，为莫诺苷的动力学研究提供了稳定、可靠、方便的检测手段。研究发现，莫诺苷在比格犬体内的AUC（0-∞）与剂量呈现良好的线性关系，提示其为线性动力学过程，并且主要的药代动力学参数MRT、t1／2z、Tmax、CLz、和Vz在各剂量组中无显著性差异。本研究建立的检测方法以及比格犬体内的动力学结果为今后全面评价莫诺苷的体内外代谢性质打下了良好的基础。

［1］ Xie X Y，Wang R，Shi Y P.Biochem Syst Ecol，2012，45：120

［2］ Wang W，Sun F L，An Y，et al.Eur J Pharmacol，2009，613：19

［3］ Wang W，Huang W T，Li L，et al.Cell Mol Neurobiol，2008，28（2）：293

［4］ Wang W，Xu J D，Li L，et al.Brain Res Bull，2010，83（5）：196

［5］ Xiong S，Li J L，Zhu X Q，et al.China Journal of Chinese Materia Medica（熊山，李敬来，朱秀清，等.中国中药杂志），2013，38（19）：3378

［6］ Xiong S，Li J L，LüG Y，et al.Military Medical Sciences（熊山，李敬来，吕圭源，等.军事医学），2013，37（10）：745

［7］ Zhou L J，Li J L，Wang X Y，et al.Chinese Journal of Chromatography（周丽君，李敬来，王晓英，等.色谱），2012，30（5）：452