纳米激光粒度仪在生物药品团聚物测试中的应用

莫晓山，冯旭，杨乐

［1.湖南省计量检测研究院，长沙 410004；2.岛津企业管理(中国)有限公司北京分公司，北京 100020］

近年来生物制药市场发展迅速，2015年全世界生物药品销售预计将达到2 100亿美元，生物制药已经成为很多制药企业的发展战略方向。目前世界5个顶尖制药企业中4个是生物制药企业。除了新药研发公司外，生物仿制药行业发展也非常迅速。随着生物制药的迅速发展，各种生物药品团聚颗粒浓度测试方法不断涌现。北京化工大学的李甜等［1］研究了利用暗场散射探针法测试金纳米颗粒浓度的方法；陆晓兰等［2］用图像分析仪测定癌症组织中核仁组成区嗜银蛋白颗粒计数，并研究了其对癌症患者预后的意义；Kouri等［3］介绍了ISLH推荐的相差显微镜法对尿液中细胞的计数方法；谢敏等［4］研究了用透光率脉动检测仪(PDA)测量水中微米级别微生物等悬浮颗粒浓度的方法；张军霞等［5］采用分子排阻色谱法考察了双黄连注射液中高分子聚合杂质；顾立素等［6］采用凝胶色谱法研究了利用凝胶色谱法测定安美汀药物中高分子聚杂质。

根据粒径大小，生物药品团聚物可大致分为3类：小于100 nm，100 nm～10 μm，大于10 μm。生物制药行业最关心的是100 nm～10 μm范围粒子浓度的测试。在生物制药生产研发的每个阶段，都需要对此范围内的团聚物进行评估，这3类团聚物浓度常用测试方法：小于100 nm的样品采用体积排阻色谱法(SEC)；大于10 μm的样品采用液体颗粒计数仪；100 nm～10 μm范围内的粒子被称为亚可见粒子(SVP)。目前市场上能有效进行测量SVP团聚物浓度的方法较少。笔者以下介绍纳米激光粒度法在测定生物药品团聚物浓度方面的应用。

1 生物药品团聚过程

将西药以药物分子大小细分，大体可以分为化学药物和生物药物两类，二者在生产方法、使用方式及功效等方面有所不同。化学药物的相对分子质量较低，多采用化学合成方式生产，产品以口服药、注射药等为主；生物药品的相对分子质量较大，采用基于基因科技的生物细胞法生产。

生物药品又分为有抗体、蛋白质和核酸药物，主要类型是抗体药物。抗体药物直接消灭细胞、病毒及其它致病的抗原载体或抵消其毒性。

生物制药行业的基本任务是为患者制造和储存药物单体形式的生物药品，而团聚物是药物单体的团聚体，如图1所示。

图1 生物药品单体的团聚过程

生物药品单体的团聚现象比较普遍，如个别蛋白质特殊物理特性可能导致生物药品团聚，运输或储存过程中的振荡、外界污染，甚至用药过程中的一些因素等也会造成药品单体的团聚［7］。随着药物团聚物越来越大，其药效会随之减小，而且可能会产生危险的副作用，比如人体免疫反应导致的休克，甚至死亡［8］。所以对于生物制药生产商而言，抑制有害的团聚物形成，及时检测团聚物粒径范围及浓度变得异常重要。生物制药生产过程中药物团聚抑制研究、药物储存方法开发和质量控制都需要对药品的团聚物进行检测。

2 团聚物浓度测试原理

目前有些粒子测定仪，如岛津推出的SALD-7500 nano型粒子测定仪可以检测7 nm～800 μm范围粒子的粒径，并且可定量检测100 nm～10 μm范围内生物制药团聚物的浓度，团聚物形成过程及浓度变化［9］。例如样品A和B为不同浓度的同种颗粒样品，用传统的激光粒度测定时，可以得到散射光强度分布（如图2所示）。

图2 样品A和样品B的光强度分布图

虽然各检测器元件之间的相对强度关系是相同的，单一元件所测的光强度与颗粒的浓度成正比，但传统激光粒度仪只能得到相同的粒度分布数据，而不能发现浓度的不同（如图3所示）。SALD-7500nano系统能够进一步分析与颗粒浓度成正比的光强度数据，并通过聚苯乙烯标准颗粒溶液进行校准，获得以质量浓度(μg／mL)形式给出的粒度分布数据，即浓度分布（如图4所示）。

图3 相对粒度分布图

图4 颗粒的浓度分布图

3 生物药品团聚物浓度测量应用实例

在监控生物药品团聚物的实验结果中，若峰高增大，表示团聚物数量增加；若峰向大粒子方向移动，则表示团聚物粒径增大（如图5所示）。

在生物医药中，为防止药品发生团聚，通常加入药物稳定剂来阻止药物团聚的形成，而药物稳定剂的效果评估则需要监测团聚物浓度。在图6、图7所示的例子中，L-精氨酸被当作稳定剂添加到牛血清蛋白（BSA）分散液（pH5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液）中。在人为机械搅拌刺激下，团聚物很快形成，而稳定剂抑制团聚的效果可以定量评估。从图6结果显示，加入L-精氨酸的牛血清蛋白分散液中，团聚物颗粒数量明显减少，实验数据见表1。图7为加入L-精氨酸与不加L-精氨酸搅拌处理后牛血清蛋白团聚物浓度的测量结果。

图5 SALD-7500nano 测定聚合物浓度结果图

图6 不同搅拌时间下加入L-精氨酸前后团聚物浓度

图7 BSA团聚测定结果

表1 牛血清蛋白加入L-精氨酸前后团聚物浓度 μg/mL

4 结语

探讨了生物制药蛋白质团聚物浓度测量的重要性，并通过测定实例，介绍了一种采用纳米激光粒度法测定生物药品团聚物浓度的方法。此方法既可以测量纳米级颗粒样品的粒度范围，又可以对生物药品中药物单体团聚物浓度进行测试监控，以对药品药效、安全性能等方面进行评价。

［1］李甜，许潇，徐重行，等.金纳米颗粒暗场散射成像计数检测凝血酶［C］//中国化学会第29届学术年会.北京，2014.

［2］陆晓兰，易为民，王兰芬.细胞核DNA含量测定和AgNOR颗粒计数对预测卵巢囊腺癌患者预后的意义［J］.癌症，2003，22(1): 62–65.

［3］Kouri T，Gyory A，Rowan R M. ISLH recommended reference procedure for the enumeration of particles in urine ［J］. Lab Hematol，2003(9): 58-63.

［4］谢敏，刘小波.透光率脉动检测仪PDA在水中颗粒计数中的应用［J］.净水技术，2009，28(4): 71-73.

［5］张军霞，仲平.分子排阻色谱法检测双黄连注射液中的高分子杂质［J］.沈阳药科大学学报，2014，31(6): 468-471.

［6］顾立素，胡昌勤，金少鸿.安美汀中高分子杂质的分离分析与质量控制［J］.药物分析杂志，2001，21(1): 13-15.

［7］袁雯玮.高分子聚合物研究与中国药典2005年版β-内酰胺类抗生素高分子聚合物修订情况及操作要点［J］.中国抗生素杂质，2005，30(12): 727-730.

［8］王秀玲，张岳光，张静. IgA-纤维连接蛋白聚合物的影响［J］.医药与保健，2014，22(1): 2-4.

［9］日本岛津公司. SALD–7500nano纳米激光粒度仪［J］.传感器世界，2013(10): 52-52.