利用微卫星标记对绵羊进行亲子鉴定

刘龙腾， 贾春旸， 努尔力·阿不力孜， 张文祥， 赵宗胜

(石河子大学动物科技学院，新疆 石河子832003)

在现代动物育种中，由于要利用各种亲属的表型信息，准确的系谱记录十分重要，然而在有些情况下，不能准确地确认某些个体的父本，不能准确地判断个体的亲缘关系，从而影响绵羊育种工作的顺利开展。因此对家畜特别是种公畜的系谱确证就显得更为重要。

用微卫星DNA 进行亲子鉴定是一新兴的生物技术，在国内外多种家畜和动物上做过试验并取得较好的结果。Glowatek-Mullis 等［1］用分属不同染色体的多态微卫星位点成功解决了以前用血型无法解决的35 头牛的血缘控制问题。Fredholm 等［2］用6 ～9 个分属不同染色体的多态微卫星位点鉴定了来源于12 个品种狗的血缘，此外还利用微卫星位点对一个有争议的母本进行了确认(概率99.99%)。Hygen 等［3］对用微卫星位点进行血缘鉴定进行了评估，使用分属7 条染色体的22 条微卫星在牛群中分2 种情况计算排除概率，在被怀疑个体基因型未知时排除概率大于 0.998 6，被怀疑者基因型已知时排除概率大于0.999 9。Luikart 等［4］用分属16 条染色体上22 个微卫星位点对山羊进行亲子鉴定，结果表明在开士米山羊、安哥拉山羊和萨能山羊中排除概率分别为:大于0.999 999、大于0.999 99、大于0.999 9，同时证明两个个体完全相同的概率为1×10-15。

本试验采用微卫星DNA 分子标记的方法，利用

BM4621、BM143、OarHH55、OarJMP8、BM6438、BM6506、BM1824、OarDB6、ILSTS004 9 个微卫星位点，对132 只中国美利奴羊中的7 组亲子进行亲子鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验血样制备及基因组DNA 的提取［5］

血液样本取自新疆紫泥泉种羊场的132 只中国美利奴羊(新疆军垦型)，其中包括7 个不同的亲子关系清楚的个体及其父母本。祖代及后代羊都饲养于该场，饲养管理稳定，无疾病史。绵羊颈静脉采血约6 ml，参照刘云芳等［6］的方法提取绵羊基因组DNA。

1.2 微卫星位点引物合成及PCR 扩增

选取的9 个微卫星引物均由上海生物工程公司合成，其碱基序列及退火温度见表1。PCR 扩增反应体系:10×Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl，上下游引物各3.0 μl (5 pmol/μl)，TaqE(0.5 U/μl)4.0 μl，模板DNA (50 ng)2.0 μl，总体积25.0 μl。PCR 扩增条件为:95℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，在适宜的温度退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.3 扩增产物的电泳检测

25 μl PCR 产物中加 3 ～5 μl 溴酚蓝指示剂，混匀后加10 μl 在聚丙烯酰胺凝胶(浓度为10%)中电泳，稳压150 ～180 V，电泳 6 ～8 h。电泳结束后进行固定、染色、显影过程，凝胶成像系统拍照。

采用银染的方法，染色及显影的过程如下:将凝胶放入固定液中预处理10 min，然后将凝胶放入染色液中染色25 min，取出后用蒸馏水漂洗15 ～20 s，置于显影液中，约 8 ～10 min 出现条带后，取出凝胶用自来水快速漂洗2 次，放入固定液终止10 min，观察结果并拍照［7］。

表1 9 个微卫星标记的引物序列及退火温度Table 1 Primer sequences of nine microsatellite markers and reference annealing temperatures

1.4 数据处理及统计方法

1.4.1 基因频率及基因型频率 基因频率是指群体内某一基因座上特定等位基因占该基因座等位基因总数的比率(Pi)，即为等位基因频率，是群体遗传特征的基本要素。Pi=［2(ii)+(ij1)+(ij2)+…+(ijn)］/2N，其中，Pi为某一位点上第i个等位基因的频率，i为该位点上的第i个等位基因，j1、j2、…、jn为与i共显性的第1 到第n个等位基因;N为该位点上的等位基因数。基因型频率是指一个群体内某特定基因型所占的比例，它是描述群体遗传结构的重要参数。由于微卫星扩增结果为共显性等位基因，因此，表型频率即为基因型频率，基因型频率=基因型个体数/测定群体总数。

1.4.2 Handy-Weinberg 平衡的χ2适合性试验Handy-Weinberg 平衡状态的检验采用χ2适合性检验进行。首先根据基因频率计算各种基因型频率的理论值，然后计算χ2值。χ2=∑(E-O)2/E，E为理论值，O为实际观察值。

1.4.3 父权概率计算［8-9］根据所检测的表型，分别列出母本、子一代及假设父本的各种可能的基因型。根据母子组合，确定来自母本的基因(母本基因)和必定来自子一代父本的基因(父本基因)。计算嫌疑父本成为子一代父本的概率:X=f×c，式中f为母本提供母本基因的概率(当只有一种母本基因时，该基因100%遗传给子代，故此时母本基因概率为1)，c为嫌疑父本提供父本基因的概率。计算种群中随机个体成为子一代父本的概率:Y=f×g，式中f为母本提供母本基因的概率，g为种群中该父本的基因频率。计算父权指数(PI)，PI=X/Y。再计算父权的相对机会RCP(Relative Chance of Paternity)值和累积RCP，RCP=PI/(PI+1)，累积RCP=1-(1-RCP1)(1-RCP2)……(1-RCPn)。

2 结果与分析

2.1 等位基因频率分布

由表2 可知，9 个微卫星位点共检测到56 个等位基因，平均每个位点6.2 个。OarHH55 位点等位基因最多，共检测到8 个;BM6506、BM6438、BM1824 3 个位点都只检测到5 个等位基因。

表2 绵羊9 个微卫星位点基因频率分布Table 2 Allele frequencies of 9 STR loci in sheep

2.2 9 个STR 基因位点的基因分型

从表3 可以看出:在对7 组父母本与子代的亲子鉴定中，第1 组的累积RCP值为0.999 8，第2 组的累积RCP值为0.999 9，第3 组的累积RCP值为0.999 9，第4 组的累积RCP值为 0.999 8，第5组的累积RCP值为0.999 9，第6 组的累积RCP值为0.999 9，第7 组的累积RCP值为0.999 9。这7组累积父权概率都已达到很高的鉴别水平，说明本试验所用的9 个微卫星位点都可用做鉴定绵羊亲子关系的微卫星标记位点。

表3 9 个微卫星位点PI 值及RCP 值Table 3 PI and RCP values of 9 STR loci

3 讨论

亲子鉴定又称亲权鉴定，SSR 分子标记技术［10-11］是目前国内外进行亲子鉴定的新技术之一。贾名威等［12］在奶牛和肉牛中分别择选了6 个微卫星座位，累积个体鉴别力和累积非父排除能力都很高。Ellegren 等［10］组合5 个微卫星位点(每个位点至少有6 个等位基因)排除率达98%以上，使用10个微卫星位点可使排除率达99.99%。贾斌等［13］利用10 个微卫星座位对新疆8 个绵羊品种进行遗传多样性分析，结果表明8 个高度多态性的座位可用于遗传多样性分析。Araujo 等［14］用11 个微卫星标记对巴西山羊进行亲权鉴定研究，结果表明，当已知一方亲本时的累计父权排除率为 0.999 59。张志和等［15］在大熊猫的亲子鉴定中，父权排除率达到了0.999 921。李洁等［16］择选13 个微卫星标记对甘肃高山细毛羊进行亲子鉴定，累计父权排除概率为0.999 94，11 个高度多态的座位使累计父权排除率达到0.999 85。周磊等［17］利用微卫星技术研究亲子鉴定，证明了微卫星座位的多态性决定了父权排除率的大小。钱林东等［18］使用微卫星标记分析发现，一般检测的遗传座位多少与鉴定概率成正比，相同的微卫星位点在群体中的等位基因数与正确鉴定结果的概率也成正比。本研究采用微卫星DNA 分子标记技术分析计算了132 只中国美利奴羊在9 个微卫星位点的等位基因频率及其分布规律，9 个微卫星位点均表现为高度或中度多态性;对其中7 组父系半同胞亲子进行了亲子鉴定，获得了0.999 8 ～0.999 9 的父权概率，说明这9 个微卫星位点在亲缘关系较近的群体中做亲子鉴定是可行的，这为绵羊亲子鉴定试剂盒的研制奠定了基础。

用微卫星DNA 或DNA 测序进行亲子鉴定技术精确度较高，发展较快，但由于成本问题在家畜中较难开展和推广。随着分子生物学的发展和测序成本的降低，基于分子生物学的亲子鉴定技术必将在家畜中得到广泛的应用。所以筛选用于亲子鉴定的可靠、合适的微卫星位点代替血型、DNA 指纹等传统方法进行血缘鉴定和血缘控制在家畜中的应用潜力很大。

［1］ GLOWATZKI-MULLIS M L，GAILLARD C，WIGGER G，et al.Microsatellite-based parentage control in cattle［J］.Anim Genet，1995，26(1):7-12.

［2］ FREDHOLM M，WINTERO A K.Efficient resolution of parentage in dogs by amplification of microsatellites［J］.Anim Genet，1996，27(1):19-23.

［3］ HEYEN D W ，BEEVER J E .Exclusion probabilities of 22 bovine microsatellite markers in fluorescent multiplexes for semiautomated parentage testing［J］.Animal Genetics，1997，28:21-27.

［4］ LUIKART G，BIJU D M P，ERTUGRUL O，et al.Power of 22 microsatellite markers in flurescent multiplexes for parentage testing in goats［J］.Animal Genetics，1999，30:431-438.

［5］ 萨姆布鲁克丁，弗时奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆试验指南［M］.2 版.金冬雁，译.北京:科学出版社，1998:456-467.

［6］ 刘云芳，高剑峰，潘晓亮，等.绵羊全血中DNA 的微量提纯［J］.石河子大学学报:自然科学版，1997，1(2):136-138.

［7］ 石 锐，郭长虹.聚丙烯酰胺凝胶中DNA 的银染方法［J］.生物技术，1998，8(5):46-48.

［8］ 程大霖.个体识别和亲权鉴定理论与实践［M］.北京:中国检查出版社，2001:24-27.

［9］ 吴继法，吴登俊.微卫星DNA 在家畜亲子鉴定中的应用与研究进展［J］.国外畜牧科技，2001，28(5):28-30.

［10］ EUEGREN H，JOHANSSON M，SAND B K，el a1.Cloning of highly polymorphic micro satellite in the horse［J］.Anim Genetics，1992，23:133-142.

［11］ 方盛国，冯文和.大熊猫亲子鉴定:DNA 指纹技术的应用［J］.四川大学学报:自然科学版，1994，31(3):389-395.

［12］ 贾名威，杨利国，管 峰，等.奶牛和肉牛6 个STR基因座遗传多态性研究［J］.遗传，2004，26(3):309-314.

［13］ 贾 斌，陈 杰，赵茹茜，等.新疆8 个绵羊品种遗传多样性和系统发生关系的微卫星分析［J］.遗传学报，2003，30(9):847-854.

［14］ ARAUJO A M，GUIMARAES S E F，PEREIRA C S，et al.Paternity in Brazilian goats through the use of DNA microsatellites［J］.Revista Brasileira de Zootecnia，2010，39:1011-1014.

［15］ 张志和，沈富军，孙 姗，等.应用微卫星分型方法进行大熊猫父本鉴定［J］.遗传，2003，25(5):504-510.

［16］ 李 洁，罗玉柱，李少斌，等.甘肃高山细毛羊微卫星遗传多样性及亲子鉴定研究［J］.农业生物技术学报，2013，21(2):199-205.

［17］ 周 磊，初 芹，刘 林，等.利用微卫星和SNP 标记信息进行奶牛亲子鉴定的模拟研究［J］.畜牧兽医学报，2011，42(2):169-176.

［18］ 钱林东，张自芳，田应华，等.利用微卫星DNA 标记进行黄牛的亲子鉴定［J］.云南农业大学学报:自然科学版，2010，25(1):69-74.