过氧化氢诱导人黑素细胞氧化应激损伤模型的建立

田 军，朱龙飞，坚 哲，刘邦民，李 强，李春英，高天文

白癜风是一种常见的色素脱失性疾病，临床上主要表现为皮损处色素消失[1]。目前，关于白癜风的病因尚不清楚，其皮损处黑素细胞被破坏的机制也较复杂[2]。因此，了解和掌握白癜风具体发病机制对预防和治疗白癜风具有重要的意义。以往研究认为，白癜风的发生与遗传、内分泌、自身免疫等诸多因素有关，近年来越来越多的研究显示氧化应激在其发病中起关键作用，而通常认为起关键作用的自身免疫因素则可能是氧化应激导致黑素细胞被破坏后的继发现象[3]。氧化应激可以产生活性氧簇（reactive oxygen species, ROS），它包括各种氧自由基，其中H2O2是主要成员，它可以直接或间接的损伤细胞，诱导细胞凋亡和坏死[4]。有研究表明，H2O2的过量蓄积是氧化应激参与白癜风发病最直接的证据之一[5]。然而由于缺乏合适的实验模型，目前白癜风的研究较为困难。因此，我们采用人永生化黑素细胞系PIG1 为研究对象，以H2O2作为诱发氧化应激损伤的因素，建立体外模拟 ROS 诱导氧化应激的细胞模型，为研究白癜风氧化应激发病机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人永生化黑素细胞系PIG1 由美国芝加哥大学Caroline Le Poole 教授馈赠，254 培养基（Invitrogen公司），胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco BRL 公司），CCK-8 细胞活性检测试剂盒及ROS 检测试剂盒（碧云天公司），Annexin V-FITC / PI 细胞凋亡试剂盒（麦博公司），丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成公司），H2O2等其他试剂均为国产分析纯。倒置显微镜（NikonES2000），酶标仪（BIORAD680 型），流式细胞仪FACS Calibur（BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 PIG1 细胞培养于含 5%胎牛血清254 培养基中，5% CO2、37 ℃培养，取对数生长期细胞用于实验，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，按 1×106/ml 密度接种于 96 孔或 6 孔板中，培养至细胞贴壁约 80%时分组处理。分别用H2O2终浓度为 0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L 的培养基培养 PIG1 细胞24 h，进行下一步实验。

1.2.2 细胞形态观察 倒置显微镜观察处理后各组细胞的形态学变化。

1.2.3 细胞凋亡检测 消化收集各组细胞，分别加入100 μl Binding Buffer 和Annexin V-FITC（20 μg/ml）10 μl，室温避光30 min，再加入PI（50 μg/ml）5 μl，避光反应5 min 后，加入400 μl Binding Buffer，流式细胞仪检测凋亡率，以不加Annexin V-FITC 及PI 各一管作为阴性对照。

1.2.4 细胞内ROS 水平检测 去除已处理好的 6 孔板中培养基， PBS 洗涤1 次，每孔加入1 ml 按照1∶1 000 无血清254 培养基稀释的ROS 荧光探针DCFH-DA，孵育20 min，弃上清后PBS 洗涤3 次，消化收集各组细胞，800 r/min，离心5 min，PBS 洗涤3 次，流式细胞仪检测平均荧光强度。

1.2.5 细胞活性检测 向已处理好的 96 孔板每孔加入10 μl CCK-8 试剂，37 ℃，5% CO2孵箱中孵育 1 h 后，酶标仪测定 490 nm 处各孔A 值，计算公式：细胞活性= A490(处理组)/ A490(对照组)×100% 。

1.2.6 MDA 检测 采用硫代硫酸巴比妥法（TBARs），每组均取 1×106个处理好的细胞，3 000 r/min，离心 10 min，弃上清，在沉淀中加入 0. 6 ml 双蒸水，置旋涡混匀器上混匀 1 min，加 0.3 ml 无水乙醇，混匀 30 s，加三氯甲烷 0.3 ml，混匀 1 min，3 500 r/min，离心 10 min 后吸取上层MDA 抽提液0. 8 ml，试剂盒检测。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度H2O2 处理后黑素细胞形态学变化

不同浓度H2O2处理后黑素细胞形态学变化见图1。倒置显微镜下观察显示正常的黑素细胞形态呈树突状，两极、三极或多极，部分区域连接成网状。随着作用浓度的增加，黑素细胞体积变小，树突数量减少，长度缩短，凋亡及坏死逐渐增加。

图1 不同浓度H2O2处理24 h后黑素细胞形态学变化

图2 不同浓度H2O2 对人黑素细胞凋亡的影响

图3 不同浓度H2O2 对人黑素细胞内ROS的影响

2.2 不同浓度H2O2 对PIG1 细胞凋亡情况的影响

不同浓度H2O2对PIG1 细胞凋亡情况的影响见图2。流式细胞仪凋亡分析结果显示，在 0.50 mmol/L H2O2处理组黑素细胞就开始发生凋亡，随着 H2O2浓度的增加，PIG1 细胞凋亡率逐渐增高，0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、和 2.00 mmol/L H2O2处理24 h 后， PIG1 细胞的总凋亡率分别为6.8%、11.5%、15.6%、22.7%、38.7% 和57.5%。

2.3 不同浓度H2O2 对PIG1 细胞内ROS 产生的影响

不同浓度H2O2对PIG1 细胞内ROS 产生的影响见图3。实验发现H2O2对 PIG1 细胞内ROS 产生的影响存在浓度依赖关系，随着H2O2浓度的增加，PIG1 细胞内ROS 水平逐渐升高。以 0 mmol/L 浓度组作为对照相比，0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L H2O2处理组PIG1 细胞24 h 后平均荧光强度 分 别 为 （269.8±11.46）、（315.0±1.27）、（450.1±3.75）、（856.5±46.4）、（1216.0±19.2）、（1714±109.2），从1.00 时开始具有统计学意义（P ＜0.05）。

2.4 不同浓度H2O2 对PIG1 细胞活性的影响

不同浓度H2O2对PIG1 细胞活性的影响见表1。H2O2对 PIG1 细胞活性的影响存在浓度依赖关系，随着H2O2浓度增加，PIG1 细胞的生长活力逐渐降低，从1.0 mmol/L 时开始具有统计学意义（P ＜0.05）。

2.5 不同浓度H2O2 对PIG1 细胞MDA 产生的影响

不同浓度H2O2对PIG1 细胞MDA 产生的影响见表2。随着H2O2浓度的增加，PIG1 细胞MDA 产生量逐渐增加，从1.00 mmol/L 时开始具有统计学意义（P ＜0.05）。

表1 不同浓度H2O2 对人黑素细胞活性的影响 ±s）

表1 不同浓度H2O2 对人黑素细胞活性的影响 ±s）

注 ：与对照组比较，* P<0.05

0.50 98.0±2.02 0.412 H2O2浓度(mmol/L) 活性率(%) P值（与对照组比）0 101.7±2.61 0.75 95.2±1.83 0.050 1.00 79.7±4.28* 0.000 1.25 57.1±3.09* 0.000 1.50 46.9±1.94* 0.000 2.00 28.6±2.54* 0.000

表2 不同浓度H2O2 对人黑素细胞MDA产生的影响 ±s）

表2 不同浓度H2O2 对人黑素细胞MDA产生的影响 ±s）

注 ：与对照组比较，* P<0.05

H2O2浓度(mmol/L) MDA P值（与对照组比）0 101.7±2.61 0.50 98.0±2.02 1.000 0.75 95.2±1.83 0.512 1.00 79.7±4.28* 0.001 1.25 57.1±3.09* 0.000 1.50 46.9±1.94* 0.000 2.00 28.6±2.54* 0.000

3 讨论

人体皮肤在正常情况下，表皮细胞内自由基的产生和清除处于动态平衡状态，细胞会受到自由基防御系统和损伤修复系统的双重保护[6]。细胞有氧代谢会产生少量H2O2、HO- 等活性氧自由基，黑素细胞合成黑素的过程中及紫外线的照射也会引起表皮 H2O2的蓄积。H2O2可产生羟自由基，引起脂质过氧化反应，还可以自由穿过细胞膜和核膜，因此对细胞的损伤最大。皮肤在受到外源性毒物、药物或各种有害刺激时亦可产生大量的氧自由基，当自由基的产生超出机体清除能力时，就会产生氧化应激[7]。目前大量研究表明白癜风的发生与氧化应激损伤密切相关，其中最直接最有力的证据就是有国外学者在进展期白癜风患者表皮中检测到了过量蓄积的H2O2[5]。

通过查阅以往的文献，笔者选择了6 个H2O2处理浓度 (0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L) 和作用时间 (24 h)。实验中发现，随着H2O2处理浓度的升高，黑素细胞活性逐渐下降，细胞凋亡比率逐渐升高，细胞内ROS 和MDA 产生逐渐增加，存在着明显的剂量依赖关系。1.00 mmol/L 的H2O2作用于PIG1 细胞 24 h 后，细胞活性、细胞内ROS 及MDA水平改变差异有统计学意义，同时细胞凋亡率也不高，这说明在此浓度作用下细胞既可以产生氧化应激状态又不至于死亡过多，还可进行下一步的干预和培养，因此我们确定1.00 mmol/L 的H2O2处理24 h 为最佳实验浓度。

在H2O2复制的人黑素细胞氧化性损伤模型中，细胞的氧化损伤较为明显，表现为细胞活性下降，细胞凋亡比率增加，细胞内ROS 及脂质过氧化产物MDA 含量均增高。细胞活性下降和凋亡比率升高是H2O2对细胞造成不可逆损伤的充分体现；ROS 水平直接反映了细胞内氧化应激的程度[8]；MDA 是细胞生物膜中的不饱和脂肪酸被氧化后的代谢产物，其产量的多少可以反映细胞脂质过氧化的程度，从而间接反映氧化应激损伤的程度[9]。既往已有研究证实H2O2可以引起剂量依赖性细胞死亡，但浓度较低时主要导致细胞凋亡，浓度过高则主要引起细胞坏死[10,11]。本研究发现1.00 mmol/L H2O2处理 24 h 后细胞活性开始下降，与对照组相比组间差异有统计学意义（P ＜0.05），从其他方面看1.00 mmol/L H2O2处理24 h 后对细胞的损害不大，但从细胞凋亡率来看1.00 mmol/L H2O2处理24 h 后就开始诱发了明显的细胞凋亡和坏死，其中占主要部分的是凋亡。通过以上结果可以发现，随着H2O2浓度的增加细胞可出现明显的损伤效应，先是细胞功能的改变，损伤积累到一定程度就触发了细胞的器质性损害或不可逆的损伤。

以往有作者使用黑素瘤细胞系及原代黑素细胞建立氧化应激模型进行白癜风氧化应激损伤相关机制研究[12,13]。笔者在此基础上进一步改进，采用人永生化黑素细胞系PIG1 作为建模对象，其具有完善的黑素代谢功能及其他生物学特性[14]，更接近于人原代黑素细胞，因而具有较强特异性；也能最大限度的克服原代黑素细胞因取材个体年龄等异质性而导致的诱导条件不稳定，因而具有很强的稳定性；H2O2的处理浓度接近于白癜风患者表皮中H2O2的浓度[15]，所造成的氧化损伤过程类似于体内ROS 导致黑素细胞氧化损伤的病理过程，所以模拟性很强；另外本模型的可控性强，较原代培养来说，细胞系便于操作，易于重复。但由于该细胞系是经人乳头瘤病毒(HPV)-6 型病毒转染的永生化细胞系，其可能与原代培养的黑素细胞存在差异，因此具有一定的局限性，故用于实验研究时还需与原代培养的黑素细胞结合起来，相互印证，相互补充。

综上所述，笔者的研究建立了H2O2诱导 PIG1 细胞氧化应激损伤模型，本细胞氧化损伤模型简易，经济，便于推广，能较好地模拟氧自由基诱导的细胞死亡，为从细胞水平深入研究黑素细胞氧化应激相关疾病提供了良好的模型支持。

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