正交实验法优选当归多糖的提取工艺

袁菊丽，刘峰林

(甘肃中医学院 教学实验中心，甘肃 兰州 730000)

当归［Angelica sinensis (Olive.)Diels］属伞形科的一种多年生草本植物，别称秦归、云归、西当归、岷当归，尤以甘肃岷县所产当归药效最好。当归在我国临床经常用在中药的复方和验方中。随着对中药的不断开发和利用，当归的有效成分逐渐被分离、纯化，并对其进行相应的结构鉴定。当归多糖是当归中主要生物活性物质［1］。当归多糖的分离多采用水提、醇沉和离子交换树脂和凝胶树脂等方法［2］。生物学和药理学研究结果表明，当归多糖在抗肿瘤、肝损伤、免疫方面有明显的作用［3-6］。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

当归药材，购自甘肃岷县当归城，经鉴定为伞形科植物当归［Angelica sinensis(Oliv.)Diels］的根;葡萄糖对照品(G0 50500 中检所);浓硫酸、苯酚、乙醇等均为分析纯。

PL601 电子天平;CP124C 分析天平;UV-3300紫外可见分光光度计;G10-1 离心机。

1.2 当归多糖的提取

称取2 g 当归药材粉末，置索氏提取器中，依次用石油醚、无水乙醇回流提取至无色。所得药渣蒸馏水加热回流提取2 h，得滤液，定容至100 mL 容量瓶中，混匀后取5 mL 加醇至醇沉浓度为70%，静置过夜，离心得沉淀，加蒸馏水至50 mL 容量瓶中定容。

1.3 分析方法

多糖测定方法有苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法和3，5-二硝基水杨酸法［2］。根据预实验结果，选用苯酚-硫酸法。

1.3.1 对照品溶液的制备称定105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，定容至100 mL。

1.3.2 确定最大吸收波长分别取1 mL 的当归样品溶液，对照品溶液，蒸馏水，依次加入1 mL 的5%苯酚溶液，7 mL 的浓硫酸，混匀后沸水浴加热30 min后冷却至室温，在400 ～600 nm 扫描以确定最大吸收波长［3］。结果表明，492 nm 为最大吸收波长。

1.3.3 葡萄糖标准曲线的绘制量取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.0 mL，分别置于25 mL容量瓶中定容。取溶液各2 mL，分别加入5%苯酚1 mL，混匀后迅速加入5 mL 浓硫酸，混匀，1 ～2 min后于沸水液中加热30 min，取出自然冷却60 min。在492 nm 波长处测定其吸光度，以吸光度A 对应浓度Y 回归，得回归方程Y =0.412 0A +0.196 2(r =0.999 5)，线性范围0.020 2 ～0.141 3 mg/mL。

1.3.4 供试液中总多糖含量的测定量取供试液2 mL，按“标准曲线”项下操作，测定吸光度A 值，并代入回归方程，计算多糖含量。

多糖得率=沉淀重×多糖含量/药材的质量×100%

2 结果与讨论

根据预实验结果，采用正交实验，以提取时间、提取次数、加水量及醇沉浓度作为考察因素，每个因素分设3 个水平，选用L9(34)正交表。以当归多糖的得率作为评价指标，因素水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

取当归多糖粗粉9 份，每份10 g，85%乙醇热回流2 次(3，2 h)，每份100 mL，去除单糖、低聚糖及苷类等干扰性成分［2］。药渣按正交实验设计方案进行提取，水提液浓缩至每毫升含生药0.5 g，按正交设计的醇沉浓度醇沉，沉淀分别用适量的无水乙醇、乙醚、丙酮依次洗涤后50 ℃烘干得粗多糖。称定所得粗多糖12.5 mg 于50 mL 容量瓶中定容得供试液。按标准曲线项下含量测定方法测定，并计算多糖含量和多糖得率，结果见表2。

表2 L9(34)正交实验结果Table 2 The results of L9(34)orthogonal experiment

由表2 可知，影响当归多糖得率的因素主次顺序为:B ＞C ＞D ＞A，各因素水平的显著性方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 ANOVA table

由表2 可知，提取次数对多糖得率有显著性的影响，最优工艺为A3B3C2D1，即加12 倍量水，提取2次，每次2 h，醇沉浓度为70%。

对确定的工艺进行3 次验证性实验，多糖得率平均值为2.65%，相对标准偏差RSD 为2.28%，结果稳定，说明该工艺切实可行。

3 结论

(1)当归多糖水提醇沉的最优工艺条件为:加12 倍量水，提取2 次，每次2 h，醇沉浓度为70%，当归多糖的平均得率可达2.65%。

(2)当归多糖的水提醇沉方法简便，无需特殊设备，所用溶剂易得价廉，且多糖得率高，具有成本低、产品得率高的显著优点，具有很好的应用前景。

［1］ 杨帆，肖远胜，章飞芳，等.当归化学成分的HPLC-MS/MS 分析［J］.药学学报，2006，41(11):1078-1083.

［2］ 刘云.当归多糖的提取及含量测定［J］.现代中药研究与实践，2003，17(1):49-50.

［3］ 杨铁红，贾敏，梅其炳.当归多糖组分AP=3 诱惑小鼠脾细胞IL-2 和IFN-Y 的作用［J］. 药学学报，2006，41(1):54-57.

［4］ 胡晶，吴宏. 当归多糖对小鼠外周血造血干细胞动员作用的研究［J］.中草药，2006，37(12):1835-1838.

［5］ 胡小平，李玉云，李先何.当归多糖成分及药理学研究新进展［J］.中药材，2014，27(1):70-72.

［6］ 赵雪梅，刘吉成. 当归多糖对小鼠体外周造血干细胞动员作用的研究［J］. 中草药，2006，37(12):1835-1838.