不含二价盐卡松与DMDMH 的复配增效研究

徐亚霞，李程碑，杨俊伟

(陕西省石油化工研究设计院，陕西 西安 710054)

卡松(KATHON)的有效成分为5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMIT)与2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)，CMIT/MIT 的比值在2.5 ～4 之间，用硝酸镁作稳定剂，统称卡松，主要应用在日化、化妆品、涂料等行业的防腐杀菌。本院研究改用其它非二价盐作稳定剂的卡松(以下称无盐卡松)，避免了大量稳定剂(硝酸镁)引起的涂料、日化等产品絮凝，结块等“盐簇效应”的不良现象。

近年来，微生物对包括卡松在内的常用防腐剂产生了严重的抗药性，引起了业内人士的高度重视。王春华［1］等指出，工业杀菌剂的广泛使用和其种类的不断增加，使得抗药性微生物菌株和具有多重抗药性的菌株不断出现，给工业生产造成了巨大的经济损失。李程碑等［2］呼吁，使用日化防腐剂时应注意减轻微生物抗药性的产生，并不断推出新的复合型防腐剂。使用复合防腐剂，是减轻微生物产生抗药性的有效途径之一。将几种抑菌化学品配合使用，不仅可以拓宽抗菌谱，有效提高抗菌抑菌效果，而且可以使每种抗菌组分之间通过增效作用，增强使用效能，从而降低添加量。微生物同时对两种或两种以上的防腐剂产生抗药性的概率极低，特别是几种不同作用机理的防腐剂复合使用时，微生物对防腐剂产生抗药性的几率更低［3］。另外，使用复合防腐剂是防腐抑菌杀菌自身的需要。单一种类抗菌化合物，通常只对某一特定菌群具有杀灭或抑制效果，而造成日化、涂料等产品腐败变质的微生物种类众多，因此含有单一种类抗菌化合物的防腐剂不能满足防腐防霉的实际需求。仅含一种抗菌化合物的防腐剂在实际使用中还存在适用pH 值、最低抑制浓度和抑菌范围等多方面限制，故而推崇使用复合防腐剂。

卡松对铜绿假单胞菌的抑制作用较差，容易产生抗药性而达不到防腐效果［4］，然而假单胞菌在土壤和空气中大量存在，是涂料、日化等化工品中常见的重要有害菌，所以很难控制［5］。卡松也容易出现皮肤过敏现象。1，3-二羟甲基-5，5-二甲基海因(DMDMH)是一种甲醛缓释剂型防腐剂，在日化方面已得到了广泛的应用，因其同时具有很好的空间保护功能，在涂料中也越来越受到重视［6］。DMDMH 对细菌(包括铜绿假单胞菌)的抑制效率很高，而且不容易出现皮肤过敏，允许的添加量可高达0.6%，而DMDMH 对真菌的抑制效率则相对较差［2］，由于其添加量太小时起不到防腐作用，加量大时成本升高，而且会带来甲醛超量问题，故而常常与卡松复合使用，通常DMDMH 与卡松的比例为(300∶1)～(1 000∶1)［7］。鉴于此，本文针对无盐卡松与DMDMH 的复配展开研究，为开发一种使用成本低，更可靠安全的日化、涂料防腐剂作基础。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

无盐卡松、DMDMH 均为自制;营养琼脂、真菌培养基、琼脂粉、营养肉汤为生化试剂;氯化钠，分析纯;菌种有铜绿假单胞菌(CGMCC 1.2464)、金黄色葡萄球菌(CGMCC 1. 0089)、黑曲霉(CGMCC 3.3928)、白色念珠菌(CGMCC 2.2086);双圈牌定性滤纸。

DHP-9272 型恒温培养箱;160 L 霉菌培养箱;BXM-30 型高压灭菌器;JM-A1001 型电子天平;30-A2 型生物安全柜。

1.2 实验方法

1.2.1 抑菌圈实验将直径1 cm 的灭菌滤纸置于一定浓度的防腐剂溶液中浸泡10 min，取出，自然风干后备用。将灭菌营养琼脂培养基倾入培养皿中，待凝固后，用无菌棉签蘸取一定浓度的菌悬液，均匀涂抹在培养基上，然后将风干的滤纸片贴于其上，37 ℃，24 h 培养，测量其抑菌圈大小。

1.2.2 增效实验取5 mL 营养肉汤培养液加入试管中，121 ℃、20 min 灭菌。取1 mL 一定浓度的防腐剂溶液加至其中，再加0.1 mL 菌悬液，摇匀，置37 ℃培养。分别在24，48，72，112 h 观察其是否浑浊，并计算增效系数SI 值。

1.2.3 挑战实验参照美国药典(第21 版)微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法，取自制受试样30 g，加入菌悬液搅拌均匀，使每克受检样品最终分别含细菌量为5 ×106个、含真菌量为3 ×105，置于28 ℃培养箱。在接菌的0，7，14，21，28 d 分别取样分析，取3 g 样品，加到27 mL 灭菌生理盐水，混匀，然后再用灭菌生理盐水按10 倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量，计算受试样品是否通过挑战实验。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度无盐卡松、DMDMH 抑制细菌与真菌生长对比

选取防腐剂无盐卡松与DMDMH 的不同浓度，测试其对绿脓杆菌和白色念珠菌的抑菌圈大小，结果见图1。

图1 不同作用浓度下无盐卡松与DMDMH 抑菌圈大小对比Fig.1 Inhibition zone contrast of nonsalt KATHON and DMDMH with different concentration

由图1 可知，两种防腐剂在使用浓度为0.2%～1.5%范围内对细菌具有抑菌性，在使用浓度为0.4% ～1.8%范围内对真菌具有抑菌性，并且在该范围内，二者的抑菌性均随着防腐剂浓度的增大而呈增强趋势;同一使用浓度的无盐卡松抑制细菌或真菌生长效果大于同一使用浓度的DMDMH;同一使用浓度的无盐卡松抑制细菌生长效果大于抑制真菌生长效果，同样，DMDMH 抑制细菌生长效果也大于抑制真菌生长效果。

2.2 无盐卡松与DMDMH 协同增效抑制细菌生长效果

将无盐卡松、DMDMH 稀释至一定浓度，使其加至5 mL 营养肉汤培养液中达到一定的浓度值，然后加入装有5 mL 营养肉汤的试管中，再加入0.1 mL绿脓杆菌菌悬液，摇匀，置于恒温培养箱37 ℃培养，在规定时间观察其是否生长。以48 h 为基准，以浑浊试管之后的第一个清亮试管的防腐剂浓度作为防腐剂的最小抑菌浓度，作为计算协同增效系数SI 的依据，协调增效系数SI 计算方法［8］如下:

SI=Qa/QA+Qb/QB

式中 QA——无盐卡松单独作用时的最小抑菌浓度;

Qa——混合防腐剂最小抑菌浓度时无盐卡松的浓度;

QB——DMDMH 单独作用时的最小抑菌浓度;

Qb——混合防腐剂最小抑菌浓度时DMDMH的浓度。

当SI 值＞1 时，表明两种防腐剂具有拮抗作用;当SI 值=1 时具有相加作用;当SI 值＜1 时表明两种防腐剂具有协同增效作用，并且SI 越小说明增效作用越强，实验结果见表1。

表1 无盐卡松与DMDMH 对绿脓杆菌的协同增效抑制实验Table 1 Synergy coefficient experiment of nonsalt KATHON and DMDMH inhibit Pseudomonas aeruginosa

由表1 可知，无盐卡松与DMDMH 对细菌具有明显的协同增效抑制作用，增效系数SI 为0.59 ～0.86;当无盐卡松与DMDMH 分别以0.24 与83.3(mg/L)复配时，具有最佳协同增效效果。以此作为依据，针对细菌和真菌混合菌的增效效果作进一步研究。

2.3 无盐卡松与DMDMH 协同增效抑制细菌和真菌的混合菌生长效果

用绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的混合菌菌悬液代替绿脓杆菌菌悬液，同法做无盐卡松与DMDMH 的协同增效实验，结果见表2。

表2 无盐卡松与DMDMH 对细菌和真菌的混合菌的协同增效抑制实验Table 2 Synergy coefficient experiment of nonsalt KATHON and DMDMH inhibit bacteria and epiphyte

由表2 可知，无盐卡松与DMDMH 对细菌和霉菌的混合菌具有明显的协同增效抑制作用，增效系数SI 为0.58 ～0.88;当无盐卡松与DMDMH 分别以0.60 与200(mg/L)复配时，具有最佳协同增效效果。

2.4 无盐卡松与DMDMH 复配体系的挑战试验

为了进一步验证无盐卡松与DMDMH 复配体系的防腐效果，选自制洗洁净为研究对象，添加无盐卡松与DMDMH 有效成分之比为1.21 ∶133.3 的复配体系，使洗洁精中防腐剂的有效含量分别为12.1 mg/L无盐卡松和1 333 mg/L DMDMH(工业实际应用推介使用量为实验室研究最低抑菌浓度的10 倍)，再分别添加绿脓杆菌和白色念珠菌菌悬液，做挑战试验，结果见表3。

表3 无盐卡松与DMDMH 复配体系挑战实验结果Table 3 Challenging experiment result of the combined system of nonsalt KATHON and DMDMH

由表3 可知，添加无盐卡松与DMDMH 的洗洁净通过细菌和真菌挑战实验，说明无盐卡松与DMDMH 的1.21∶133.3 (mg/L)的复配体系，具有优良的长效抑制细菌和真菌生长的功效。

无盐卡松除了具有常规卡松抑菌性能强、抗菌谱广等特点外，还具有常规卡松不具有的很大优势，该研究为无盐卡松系列产品的推出奠定了基础，在无盐卡松与DMDMH 1.21∶133.3 (mg/L)的复配体系中稍加合适的稳定剂等辅料，就可作为一款新的效价更高的优质防腐杀菌剂在日化等工业市场推广应用。除了主要应用于化妆品防腐外，同时还可作为日化、油漆、涂料及木材等领域的防腐剂，是一种应用前景广阔的值得大力开发的产品，具有很高的社会经济效益。

3 结论

(1)无盐卡松、DMDMH 二者都具有抑制细菌、真菌生长效果，并且二者的抑菌性在一定浓度范围内随着防腐剂浓度的增大而呈增强趋势;同一使用浓度的无盐卡松抑制细菌生长效果大于抑制真菌生长效果;同样，DMDMH 抑制细菌生长效果也大于抑制真菌生长效果;但同一使用浓度的无盐卡松抑制细菌或真菌生长效果大于同一使用浓度的DMDMH。

(2)当无盐卡松与DMDMH 分别以0.24 mg/L与83.3 mg/L 复配时，对细菌具有最佳协同增效抑制效果;当无盐卡松与DMDMH 分别以0.60 mg/L与200 mg/L 复配作用时，对细菌和霉菌的混合菌具有最佳协同增效抑制效果。

(3)无盐卡松与DMDMH 的1. 21 ∶133. 3(mg/L)的复配体系，具有优良的长效抑制细菌及真菌生长的功效。

［1］ 王春华，谢小保，曾海燕，等. 微生物对工业杀菌剂的抗药性研究进展［J］.微生物学通报，2007，34(4):56-62.

［2］ 李程碑.使用日化防腐剂减少微生物的抗药性［J］.应用化工，2007，36(3):288-291.

［3］ 李程碑.复合防腐剂更安全［J］. 千色美业，2011(9):28-29.

［4］ Comish Aiexander. Method and compostions:US，7202287［P］.2007-09-19.

［5］ Smith Roger Errol，Bensaid Eric S.Antimicrobial mixtures of 1，3-bis(hydroxymethyl)-5，5-dimethylhydantino and 1，2-benzisothiazolin-3-one:US，6133300［P］. 2000-10-17.

［6］ 李程碑.涂料防腐剂的研究及应用进展［J］.现代涂料与涂装，2013，16(4):23-28.

［7］ Lutz，Patrick，Marski，et al. Broad spectrum preservative:US，6114366［P］.2000-09-05.

［8］ 李程碑，杨俊伟，李辉，等. 液体洗涤剂用防腐剂的发展及防腐体系的设计［J］. 中国洗涤用品工业，2012(10):65-72.