不同因素对魔芋愈伤组织诱导及增殖分化的影响

胡选萍

摘要：以清江花魔芋1号为试材，分析了不同因素对魔芋（Amorphophallus）愈伤组织诱导与增殖分化的影响。结果表明，培养基中激素配比为MS + 2.0 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA或MS + 2.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L KT或MS + 2.0 mg/L 2，4-D + 1.0 mg/L KT时，均能获得较高的愈伤组织诱导率;4种外植体愈伤组织诱导率之间存在差异显著，诱导率大小依次为鳞片>球茎>叶片>根段;添加活性炭（AC）可明显增强愈伤组织诱导效果;在MS + 2.0 mg/L TDZ +0.1 mg/L NAA培养基上愈伤组织分化形成不定芽的效果相对较好，分化率达96.15%，分化系数达9.52。

关键词：魔芋（Amorphophallus）;愈伤组织诱导;分化

中图分类号：Q939        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）21-5288-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.062

Effect of Different Culture Factors on Callus Induction and Differentiation

about Amorphophallus

HU Xuan-ping1，2

（1. Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi， China;

2.Shaanxi Key Laboratory of Bio-resources，Hanzhong 723000，Shaanxi，China）

Abstract：The effect that different culture factors exerted on callus induction and differentiation of Amorphophallus were researched. The results showed that when culture conditions were MS + 2.0 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA or MS + 2.0 mg/L 2，4-D + 0.5 mg/L KT or MS + 2.0 mg/L 2，4-D + 1.0 mg/L KT， optimal callus induction rate were obtained. Four different explants had significant influence on callus induction and the rate of induction was coleoptile>corm>lear>root. Moreover， AC was able to enhance callus induction rate. Besides， the effect of buds differentiation was optimum when the culture condition was MS+2.0 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA， with the rate and the ratio of differentiation being 96.15% and 9.52.

Key words： Amorphophallus;callus induction;differentiation

魔芋（Amorphophallus）是天南星科（Araceae）魔芋属（Amorphophallus Blume.）多年生草本植物，具有发达的地下块茎，富含果胶、生物碱、淀粉、17种氨基酸和多种微量元素[1]。魔芋块茎可作为中草药，其主要活性成分是魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM），具有降血糖、血脂和胆固醇，治疗糖尿病，抗肿瘤和免疫作用[2-5]，在医药方面具有广泛的利用价值和开发价值。陕南地区魔芋种植历史悠久，为国内最早发展魔芋产业的主产区之一。传统魔芋生产栽培中，通常用主球茎着生的根茎进行繁殖，繁殖系数低，易感病腐烂，严重地阻碍了魔芋的推广种植与在医药食品领域的产品开发[6，7]。由于愈伤组织是未分化的具有分生能力的原始细胞团，通过对愈伤组织进行遗传转化和化学诱导可较快获得新品种。本研究以魔芋为试验材料，分析外植体类型、植物生长调节物质等因素对魔芋愈伤组织诱导与增殖分化的影响，为促进魔芋优质种质筛选与快速繁育及其在医药、食用领域产品的深入开发提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料、试剂与仪器

以陕南当地清江花芋1号品种为试材，魔芋原球茎由陕西汉中洋县新成魔芋菌业有限公司提供。将魔芋球茎室温保存于湿润沙土中约3个月，待顶芽长至2～3 cm，球茎表面长出丰富的白色不定根，备用。

NAA、6-BA、2，4-D、KT与TDZ均为分析纯;MS培养基，自配。

SW-CJ-2D型双人单面洁净工作台，上海苏净实业有限公司;LDZX-50FBS型立式压力灭菌器，上海申安医疗器械公司。

1.2  试验方法

1.2.1  材料预处理  选择生长健壮、大小一致的魔芋球茎，用自来水冲洗掉表面的杂质，将根、球茎与顶芽（外包鳞片）分离开来，分别在流水下冲洗1～2 h。在超净工作台将球茎先用75%乙醇漂洗30 s，再用0.1%升汞浸泡20 min，处理过程中不断摇动，然后用无菌水漂洗4～5次，每次2～3 min，在铺有滤纸的培养皿中将其切分为0.5 cm3左右的切块。顶芽与不定根同样采用上述方法表面消毒，不同之处在于0.1%升汞浸泡12 min;消毒好之后，将不定根切分为长度约0.5 cm的切段，无菌条件下剥开顶芽周围包被的鳞片，将其切分为长宽各约0.5 cm的切块;顶芽接种至MS+0.1 mg/L 6-BA +0.2 mg/L IBA的培养基中培养约20 d，待叶片展开长大后，切分为长宽各0.5 cm的切块，备用。endprint

1.2.2  培养基配制   分别在MS培养基中加入不同剂量的NAA、6-BA、2，4-D、KT与TDZ，活性炭（AC）配制试验所需的培养基（表1）。各培养基中均加入3.0%蔗糖、0.6%琼脂粉、0.1% PVP，调整pH为 5.8～6.0，在121 ℃、108 kPa下灭菌20 min。

1.2.3  愈伤组织诱导  分别在1～8号培养基中接入准备好的球茎、鳞片、根段与叶片4种类型的外植体，在9号与10号培养基中仅接入球茎外植体，置于温度（25±2） ℃、相对湿度50%～60%，散射光条件下培养30 d，观察愈伤组织的形态，统计愈伤组织诱导结果。

1.2.4  愈伤组织增殖分化   将愈伤组织切分为长宽约0.5 cm的切块，接种至2号培养基进行继代培养，连续继代2个周期后，选择生长旺盛、颜色呈淡粉或白色的愈伤组织，将其切分为约0.5 cm3的切块，分别接种到2号、11号与12号培养基中，培养条件设为光照时间（昼/夜）16 h/8 h，光照度1 500～2 000 lx，（25±2） ℃、相对湿度50%～60%条件下培养30 d，观察愈伤组织的增殖与分化情况。

1.3  测量指标与统计方法

接种15 d后，去除污染与坏死材料，统计无菌外植体数（视为接种量），接种30 d后统计诱导出愈伤组织的外植体数（视为诱导数），计算诱导率。诱导率=诱导数/接种外植体总数×100%。接种30 d后统计分化出芽的愈伤组织数（视为分化数），统计每个处理形成的不定芽总数，分别计算分化率与分化系数。分化率=分化数/接种量×100%，分化系数=不定芽总数/接种量。

2  结果与分析

2.1  不同因素对魔芋愈伤组织诱导的影响

2.1.1  不同激素对魔芋愈伤组织诱导的影响  培养基中激素种类与组配不同，愈伤组织诱导率之间存在明显差异（表1）。对于鳞片外植体，激素NAA与6-BA组合配比（1～4号培养基），当培养基中NAA为2.0 mg/L、6-BA为1.0 mg/L时，愈伤组织的诱导率最高（94.44%），且与其他处理间差异显著;激素2，4-D与KT组合配比（5～8号培养基），当2，4-D为2.0 mg/L、KT为0.5 mg/L或1.0 mg/L时，愈伤组织的诱导率相对较高，可达91.43%与93.33%，且与其他处理间差异显著。从总体上分析，NAA与6-BA、2，4-D与KT两种激素组配方式，均能较好地诱导魔芋外植体脱分化形成愈伤组织，且在诱导率上差异并不明显。

2.1.2  不同外植体对魔芋愈伤组织诱导的影响  4种外植体均能诱导出愈伤组织，但不同外植体之间愈伤诱导率差异较大，且不同外植体愈伤发生方式也存在差异（表2）。结果表明，经方差分析，除根（平均诱导率为3.01%）与叶片（平均诱导率为18.76%）之间无显著差异外，其他不同外植体愈伤组织诱导率之间差异显著。4种外植体中，以鳞片的平均诱导率最高，为82.74%，球茎次之，为49.37%。由此可见，从诱导率角度分析，鳞片是诱导愈伤组织的最佳外植体。

4种外植体愈伤组织的发生位置、质地与形态等方面也存在明显不同。球茎外植体愈伤组织多发生在远培养基端切面上，多为粉色或乳白色，结构疏松、生长速度快，品质较好;鳞片内表皮处发生的愈伤组织形态、颜色、结构、生长快慢与球茎基本相似，但从切口处、外表皮处发生的愈伤组织致密坚硬、生长缓慢，不利于继代培养;叶片与根段外植体愈伤组织形成少，生长慢，且根段在培养过程中很容易褐变坏死。

2.1.3  添加活性炭对魔芋愈伤组织的影响  接种30 d后统计不同处理的愈伤组织诱导率，分析活性炭对魔芋愈伤组织诱导的影响。结果（表3）表明，添加活性碳后，愈伤组织的诱导率明显增加，平均诱导率由60.42%提高到78.13%，方差分析表明添加活性炭与不添加处理之间存在差异显著。添加活性炭后外植体褐变减慢，褐变速度降低，而且更有利于愈伤组织的形成，出愈时间提前5～7 d左右。由此可见，添加AC可增强魔芋愈伤组织的诱导效果。

2.2  魔芋愈伤组织的增殖分化

将继代培养的魔芋愈伤组织接种至相应培养基中，7 d左右在愈伤表面形成白色或淡粉色突起，10 d产生芽点，15 d成芽，外面包裹鳞片，鳞片呈白色或淡粉色，芽点在愈伤组织块上随机分布，有些芽点单独发生，有些芽点成簇发生。培养基中的激素种类与浓度不同，不定芽分化情况存在明显差异（表4）。

方差分析表明，3种处理条件下愈伤组织增殖分化存在显著差异，12号处理分化效果最好，分化率为96.15%，分化系数为9.52;11号处理次之，分化率与分化系数分别为81.48%与3.96;由此可见，TDZ比6-BA更有利于魔芋愈伤组织分化形成不定芽。培养基中添加2.0 mg/L NAA 与0.5 mg/L 6-BA（2号处理），虽然不定芽诱导率较低（27.78%），但在不定芽形成过程中，愈伤组织可以同时增殖，且形成的不定芽长势强，由于此处理也是较好的愈伤组织诱导激素配比条件，因此可作为魔芋离体培养中一步成苗的良好培养基。

3  讨论

研究表明，愈伤组织的诱导发生受外植体类型、光照条件、植物基因型等诸多因素之间相互作用影响的复杂过程，其中植物生长物质对植物离体培养中的细胞分化和形态建成具有明显的调节作用[8]，尤其是生长素类和细胞分裂素类的平衡对于诱导原基的形成非常重要[9，10]。本试验以魔芋为试材，分析了外植体类型、活性炭以及不同激素种类与配比对魔芋愈伤组织诱导与增殖分化的效应。结果表明，试验选择的4种外植体愈伤组织诱导率之间存在显著差异，诱导率从大到小依次为鳞片>球茎>叶片>根，且不同外植体愈伤组织的发生位置与组织状态也不同。endprint

一般认为NAA与6-BA组合对愈伤组织的诱导有明显的促进作用，苏承刚等[11]筛选得到南蛇棒魔芋适宜诱导的培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，吴金平等[12]获得西盟魔芋最佳愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，本研究结果也验证了NAA与6-BA对魔芋愈伤组织诱导的良好协同作用。研究报道表明，培养基中添加2，4-D对魔芋愈伤组织的诱导具有较强的抑制作用[13]，KT∶2，4-D对愈伤组织的诱导没有明显作用[14]，本试验发现2，4-D与KT组合除对根段外植体诱导效果不明显外，对其他3种外植体均能诱导形成愈伤组织，且2，4-D与KT组合的诱导效果与NAA与6-BA组合无明显差异。

另外，试验中发现添加AC可明显提高魔芋愈伤诱导效果，这可能与魔芋组培特点及AC的特性有关;由于魔芋离体培养中容易发生褐变，而AC具有较强吸附功能，同时可降低光照强度，营造黑暗环境，因此能够减缓外植体褐变，更有利于愈伤组织的形成。

参考文献：

[1] 刘佩瑛.魔芋学[M].北京：农业出版社，2004.

[2] 何亚娟，李久香.魔芋对艾氏腹水瘤（EAC）抑制作用的研究[J].肿瘤防治研究，2000（27）：197-198.

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[4] VUKSAN V， SIEVENPIPER JL，ZHENG X. et al.Konjac-mannan and American ginsing：Emerging alternative therapies for type 2 diabetes mellitus[J]. J Am coll Nutr，2001（20）：370-380.

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[11] 苏承刚，张兴国.南蛇棒魔芋的组织培养与植株再生研究[J].西南农业大学学报，2003，25（5）：393-395.

[12] 吴金平，宋志红，刁  英，等.西盟魔芋组织培养初步研究[J].河南农业科学，2007（11）：98-99，114.

[13] 马  林，张  玲，李卫锋.影响魔芋愈伤组织形成的几个因素[J].广西植物，2003（6）：553-557，576.

[14] 苏承刚，张兴国，张盛林.桂平魔芋组织培养研究[J].西南农业大学学报，2001，23（3）：228-229.

（责任编辑  赵  娟）endprint

一般认为NAA与6-BA组合对愈伤组织的诱导有明显的促进作用，苏承刚等[11]筛选得到南蛇棒魔芋适宜诱导的培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，吴金平等[12]获得西盟魔芋最佳愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，本研究结果也验证了NAA与6-BA对魔芋愈伤组织诱导的良好协同作用。研究报道表明，培养基中添加2，4-D对魔芋愈伤组织的诱导具有较强的抑制作用[13]，KT∶2，4-D对愈伤组织的诱导没有明显作用[14]，本试验发现2，4-D与KT组合除对根段外植体诱导效果不明显外，对其他3种外植体均能诱导形成愈伤组织，且2，4-D与KT组合的诱导效果与NAA与6-BA组合无明显差异。

另外，试验中发现添加AC可明显提高魔芋愈伤诱导效果，这可能与魔芋组培特点及AC的特性有关;由于魔芋离体培养中容易发生褐变，而AC具有较强吸附功能，同时可降低光照强度，营造黑暗环境，因此能够减缓外植体褐变，更有利于愈伤组织的形成。

参考文献：

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[14] 苏承刚，张兴国，张盛林.桂平魔芋组织培养研究[J].西南农业大学学报，2001，23（3）：228-229.

（责任编辑  赵  娟）endprint

一般认为NAA与6-BA组合对愈伤组织的诱导有明显的促进作用，苏承刚等[11]筛选得到南蛇棒魔芋适宜诱导的培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，吴金平等[12]获得西盟魔芋最佳愈伤诱导培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，本研究结果也验证了NAA与6-BA对魔芋愈伤组织诱导的良好协同作用。研究报道表明，培养基中添加2，4-D对魔芋愈伤组织的诱导具有较强的抑制作用[13]，KT∶2，4-D对愈伤组织的诱导没有明显作用[14]，本试验发现2，4-D与KT组合除对根段外植体诱导效果不明显外，对其他3种外植体均能诱导形成愈伤组织，且2，4-D与KT组合的诱导效果与NAA与6-BA组合无明显差异。

另外，试验中发现添加AC可明显提高魔芋愈伤诱导效果，这可能与魔芋组培特点及AC的特性有关;由于魔芋离体培养中容易发生褐变，而AC具有较强吸附功能，同时可降低光照强度，营造黑暗环境，因此能够减缓外植体褐变，更有利于愈伤组织的形成。

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[10] 熊国胜，李家洋，王永红.植物激素调控研究进展[J].科学通报，2009，54（18）：2718-2733.

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[12] 吴金平，宋志红，刁  英，等.西盟魔芋组织培养初步研究[J].河南农业科学，2007（11）：98-99，114.

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[14] 苏承刚，张兴国，张盛林.桂平魔芋组织培养研究[J].西南农业大学学报，2001，23（3）：228-229.

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