Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆与序列分析

任邵娜+袁生+蒲文珺+彭巧丽+王辉+陈志伟+张浩吉+李国清

摘要：为了了解鸭肝炎病毒的遗传变异情况，试验采用RT-PCR方法对采自广东省各地12个DHV临床分离株的VP1基因进行了扩增、克隆、测序和序列分析。结果表明，12个DHV分离株的VP1基因序列长度均为714 bp，编码238个氨基酸，12个分离株与GenBank公布的参考株核苷酸同源性为91.7%～95.8%，氨基酸同源性为94.5%～98.3%，而12个分离株之间的核苷酸序列同源性达到99.2%～100%，氨基酸同源性为97.9%～100%。系统分析证明，12个DHV分离株均为DHV-Ⅰ型，不同分离株VP1基因无碱基插入和缺失，但存在点突变，各DHV分离株间亲缘关系较近，但存在一定的遗传差异。

关键词：Ⅰ型鸭肝炎病毒;VP1基因;克隆;序列分析

中图分类号：S852.65        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）15-5208-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.041

Cloning and Sequence Analysis of VP1 Gene of Duck Hepatitis A

REN Shao-na1，2，3， YUAN Sheng2， PU Wen-jun2， PENG Qiao-li3， WANG Hui3， CHEN Zhi-wei3，4， ZHANG Hao-ji1，2， LI Guo-qing1

（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China;

2.Department of Veterinary Medicine， Foshan University， Foshan 528231， Guangdong， China;

3.Shenzhen Laboratory， AIDS Institute， University of Hong Kong LKS Faculty of Medicine/Shenzhen Third Peoples Hospital， Shenzhen 518112， Guangdong， China; 4. AIDS Institute， University of Hong Kong LKS Faculty of Medicine， Hong Kong， China）

Abstract： In order to investigate the variation of Duck hepatitis virus（DHV）， a total of 12 DHV VP1 genes from different regions of Guangdong province in China were amplified， cloned and sequenced. The results showed that the lengths of all VP1 sequences were 714 bp， encoding 238 amino acids. Homology analysis revealed that the VP1 genes of 12 isolates shared 91.7%-95.8% nucleotide identity and 94.5%-98.3% amino acids identity with the reference strain of DHV from GenBank. Nucleotide sequence homology of VP1 gene among the 12 DHV isolates varied from 99.2% to 100%， while amino acid sequence homology varied from 97.9% to 100%. The phylogenetic analysis revealed that all the 12 isolates were DHV-Ⅰ， with no InDel， but having point mutations. All 12 isolates had a close genetic relationship with a few genetic differences.

Key words： DHV-Ⅰ;VP1 gene; cloning; sequence analysis

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是一种由鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的以肝脏出血性肿大为特征的急性、烈性、高度致死性传染病，主要感染3周龄以下的雏鸭，对1周龄内雏鸭具有极强致死性[1]。病鸭临床表现为角弓反张，剖检可见肝脏肿大，有充血或出血斑。20世纪以来，该病成为危害雏鸭最为严重的疫病之一，给中国养鸭业带来巨大的经济损失[2]。

鸭肝炎病毒分为I型、II型和III型3个血清型，其中I型和III型属于小RNA病毒科，II型属于星状病毒科，三者不能引起抗原交叉反应，但引起的症状与病变基本相同[3]。星状病毒科引起的Ⅱ型鸭肝炎，目前为止仅英国有报道，与Ⅰ型鸭肝炎病毒相比，Ⅲ型鸭肝炎病毒的致病力较弱，对雏鸭的致病率很少超过30%。通常所说的鸭肝炎主要是指Ⅰ型鸭肝炎[4]。Ⅰ型鸭肝炎病毒包括3种血清型，即DHV-1（世界性分布传统株血清型）、DHV-1B（台湾地区分离株血清型）、DHV-1C（韩国分离株血清型），这3种血清型间没有交叉中和，其中最常见、致病力最强且呈世界性分布的是DHV-1血清型[5]。

DHV的VP1蛋白包含病毒的主要抗原位点，可诱导中和抗体，也可作为感染的可靠指标。Oberste等[6]对小RNA病毒科的人肠病毒（Human enteroviruses）VP1基因部分序列的同源性进行了分析比较，建立了一种血清型分型标准：即核苷酸序列同源性≥75%和/或推导的氨基酸序列同源性≥88%的毒株可判定为同一血清型。DHV-Ⅰ同属于小RNA病毒科，参照上述血清型分型标准，根据各毒株VP1基因核苷酸及氨基酸序列同源性分析结果，可以判定鸭肝炎病毒的血清型[7]。本试验以从广东不同地区鸭群分离的12个鸭肝炎病毒株为研究对象，PCR扩增其VP1基因并进行序列分析，旨在阐明鸭肝炎病毒的遗传变异情况，从而为研制鸭肝炎病毒亚单位疫苗奠定基础。

1  材料与方法

1.1  病毒株

病料采自广东省不同地区的鸭群，由佛山科学技术学院动物医学系实验室分离得到12株鸭肝炎病毒，其中清远2株、汕头1株、恩平2株、台山2株、三水1株、东莞1株、增城1株、高要1株、肇庆1株，分别命名为QY1、QY2、ST、EP1、EP2、TS1、TS2、SS、DG、ZC、GY、ZQ。

1.2  主要试剂

RNA提取试剂盒（High Pure Viral RNA Kit）为Roche公司产品;PrimeScript one step RT-PCR Kit、pMD-19T Vector、10×TAKARA Taq Buffer和DL2000 DNA Marker购自TAKARA公司;胶回收试剂盒（QIAprep Spin Miniprep Kit）购自QIAGEN公司;感受态细胞Golden由香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所深圳研究室制备。

1.3  引物设计

参照GenBank中VP1基因序列设计一对引物，上游引物为DHV-VP1-F：5′-GGT GAT TCC AAC CAG TTAG-3′，下游引物为DHV-VP1-R：5′-TTC AAT TTC CAA ATT GAG-3′，由Life Technologies公司合成。

1.4  RT-PCR扩增

取病毒尿囊液200 μL，按照说明书推荐的操作步骤提取病毒RNA。用一步法试剂盒进行RT-PCR 扩增。在50 μL PCR反应体系中加入PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL、2×1 Step Buffer 25 μL、Primers各2 μL（浓度为10 μmol/L）、模板RNA 5 μL、用ddH2O补齐至50 μL。PCR反应条件：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在紫外成像仪里观察记录结果。

1.5  目的基因的克隆和测序

将PCR产物按胶回收试剂盒（QIAprep Spin Miniprep Kit）推荐的步骤进行回收，回收后PCR产物连接到pMD19-T载体，然后转化入感受态细胞。通过菌落PCR鉴定重组质粒，筛选阳性重组质粒送华大基因测序。

1.6  VP1基因序列分析

利用DNA Star中的MegAlign对研究获得的12株DHV病毒的基因序列与GenBank中公布的DHV-Ⅰ全基因组参考序列（161/79/V株EU753359、03D株NC008250、 H株DQ249300、 5886株DQ249301、R85952株DQ226541、DRL-62株DQ219396、C80株DQ864514、A66株DQ886445、JX株EF093502、HP1株EF151312、E53株EF151313、S株EF417871、F株EU264072、R株EF585200、ZJ株EU841005、X株FJ496343、AV2111株EU395440、CL株EF427899）进行比对，并与部分代表性参考序列比较其核苷酸和氨基酸同源性。同时用Mega 4.0软件对获得的序列以及DHV-Ⅰ参考序列、韩国新型毒株参考序列（AP-04114株DQ812093、AP-04203株DQ256134、AP-04009株DQ256133、AP-03337株DQ256132）、台湾地区新型毒株参考序列（90D株EF067924、04G株EF067923）进行比对及计算遗传距离，然后用Mega 4.0程序中的邻接法（Neighbor-joining method， NJ）绘制系统发育树。

2  结果与分析

2.1  PCR扩增结果

采用一步法RT-PCR扩增，检测结果（图1）显示，12株病毒分离株均扩增出714 bp的条带，与目的基因大小基本相符。

2.2  VP1基因核苷酸和氨基酸同源性分析

测序结果显示，12株病毒的目的基因大小均为714 bp，编码238个氨基酸。利用MegAlign软件对扩增出的12株病毒的VP1基因和GenBank上下载的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列进行比对（图2），比较不同地区分离株间的序列同源性，并对推导的氨基酸序列进行比对（图3）。结果发现，12株分离株与参考株DHV的核苷酸同源性为91.7%～95.8%，氨基酸同源性为94.5%～98.3%;12株分离株之间的核苷酸同源性为99.2%～100%，氨基酸同源性为97.9%～100%。参照同属于小RNA病毒的人肠病毒（Human enteroviruses）血清型分型标准，12株分离株均为DHV-Ⅰ型，且各个分离株间同源性很高，说明各地区间DHV变异不大。其中，分离自肇庆和高要的2株病毒以及分离自三水和增城的2株病毒的VP1基因序列同源性最高，为100%，说明肇庆与高要之间、三水与增城之间的DHV毒株亲缘关系最近。

2.3  VP1基因核苷酸和氨基酸序列比对分析

与参考毒株相比，12株分离株均存在散在点突变现象，氨基酸也存在少数点突变，但没有插入和缺失现象。分离株与参考株的氨基酸序列比对发现，在第49位12株分离株全部为S，与弱毒株A66相同，而强毒株161/79/V为T，推测12株分离株为弱毒株。此外，12株分离株之间也有散在碱基和氨基酸的点突变，在139、214、354、382、471、523、560、577、676 bp位置共有9处碱基位点出现点突变;而氨基酸突变位点有7个，位置在第47、72、128、175、187、193、226位，这些核苷酸和氨基酸位点为研究DHV基因结构中决定毒力的基因位点奠定了基础。12株分离株与DHV-Ⅰ参考株之间的核苷酸变异区域部分图解见图4。

2.4  系统进化分析

用Mega软件对12个分离株和参考株进行系统发育进化树的构建（图5），结果发现，12株分离株与DHV-Ⅰ参考株处于同一个大的分支上，而韩国新型毒株和台湾地区新型毒株分别处于另外两个大的分支，说明12株分离株均为DHV-Ⅰ型。12株毒株分别处于不同小分支，说明分离株之间亲缘关系近，但存在一定的地域差异。

3  小结与讨论

小RNA病毒的结构蛋白VP1基因是病毒抗原性的主要决定成分。DHV-Ⅰ的VP1基因编码的蛋白位于病毒核衣壳表面，能诱导动物产生中和抗体， DHV-Ⅰ VP1基因的核苷酸序列是一个高度可变区，其基因结构和功能仍未明确，分析这个高变区对DHV遗传变异的研究有指导意义[8-10]。

本研究测定的12株I型鸭肝炎病毒VP1基因序列长度为714 bp，编码238个氨基酸。与参考株VP1基因的大小一致，应用DNA Star对所测毒株 VP1基因序列进行了同源性分析，并绘制了系统进化树，结果显示所测得12株DHV分离株的VP1 基因的核苷酸序列同源性为99.2%～100%，氨基酸序列同源性为97.9%～100%，而与参考毒株VP1基因序列的核苷酸序列的同源性为91.7%～95.8%，氨基酸序列同源性为94.5%～98.3%。系统进化树显示共有3个分支，12株DHV分离株均与DHV-Ⅰ处于同一分支，亲缘关系近;而与新型变异株台湾地区株以及韩国株处在不同分支，亲缘关系较远。结果表明试验所分离的DHV毒株为一个群，都属于DHV-I。另试验结果比对分析表明，12株分离株均存在核苷酸和氨基酸的点突变，氨基酸的点突变可以引起病毒抗原性的变化，分析这些点突变有助于研究病毒基因结构中决定毒力的基因位点。而分离株VP1基因核苷酸序列中的某些点突变并没有引起氨基酸的变化，说明病毒表型变化程度低于遗传变异程度[11]。

本研究从基因水平上研究病毒遗传变异情况，分析其基因型，揭示与其他毒株的亲缘关系，为该病在流行病学、亚单位疫苗研制和预防控制方面的研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 邵泽香，韦  强，鲍国连，等.Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J].浙江农业学报，2009，21（5）：434-438.

[2] 何冉娅，于  淼，张玉玲，等.2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析[J].中国动物传染病学报，2010，18（1）：7-15.

[3] SAIF Y M. Diseases of Poultry[M]. 11th Edition. America： Iowa State Press，2003.339-351.

[4] 张艳芳，罗  薇，刘内生，等.鸭肝炎病毒的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38（7）：171-175.

[5] LIU M， ZHANG T T， ZHANG Y，et al. Development and evaluation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus[J]. Journal of Virological Methods.2010，169（1）： 66-69.

[6] OBERSTE M S，MAHER K，KILPATRICK D R，et al.Typing of Human enteroviruses by partial sequencing of VP1[J].J Clinical microbial，1999，37（5）：1288-1293.

[7] 袁率珍，范书才，李  虹，等. 鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]. 中国预防兽医学报，2010，32（11）：849-853.

[8] LI C F， CHEN Z Y， MENG C C，et al. High yield expression of duck hepatitis A virus VP1 protein in Escherichia coli， and production and characterization of polyclonal antibody[J]. Journal of Virological Methods. 2013，191（1）：69-75.

[9] LIU G Q， WANG F， NI Z，et al. Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus type I （DHV-I） isolates from southeast China is related to isolate attenuation[J]. Virus Research，2008，137（1）：137-141.

[10] TSENG C H， TSAI H J. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J]. Virus Research，2007，126（1-2）：19-31.

[11] 邵泽香，韦  强，鲍国连，等.鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析[J].中国兽医学报，2010，30（8）：1052-1055.

（责任编辑  曾德芳）

2.3  VP1基因核苷酸和氨基酸序列比对分析

与参考毒株相比，12株分离株均存在散在点突变现象，氨基酸也存在少数点突变，但没有插入和缺失现象。分离株与参考株的氨基酸序列比对发现，在第49位12株分离株全部为S，与弱毒株A66相同，而强毒株161/79/V为T，推测12株分离株为弱毒株。此外，12株分离株之间也有散在碱基和氨基酸的点突变，在139、214、354、382、471、523、560、577、676 bp位置共有9处碱基位点出现点突变;而氨基酸突变位点有7个，位置在第47、72、128、175、187、193、226位，这些核苷酸和氨基酸位点为研究DHV基因结构中决定毒力的基因位点奠定了基础。12株分离株与DHV-Ⅰ参考株之间的核苷酸变异区域部分图解见图4。

2.4  系统进化分析

用Mega软件对12个分离株和参考株进行系统发育进化树的构建（图5），结果发现，12株分离株与DHV-Ⅰ参考株处于同一个大的分支上，而韩国新型毒株和台湾地区新型毒株分别处于另外两个大的分支，说明12株分离株均为DHV-Ⅰ型。12株毒株分别处于不同小分支，说明分离株之间亲缘关系近，但存在一定的地域差异。

3  小结与讨论

小RNA病毒的结构蛋白VP1基因是病毒抗原性的主要决定成分。DHV-Ⅰ的VP1基因编码的蛋白位于病毒核衣壳表面，能诱导动物产生中和抗体， DHV-Ⅰ VP1基因的核苷酸序列是一个高度可变区，其基因结构和功能仍未明确，分析这个高变区对DHV遗传变异的研究有指导意义[8-10]。

本研究测定的12株I型鸭肝炎病毒VP1基因序列长度为714 bp，编码238个氨基酸。与参考株VP1基因的大小一致，应用DNA Star对所测毒株 VP1基因序列进行了同源性分析，并绘制了系统进化树，结果显示所测得12株DHV分离株的VP1 基因的核苷酸序列同源性为99.2%～100%，氨基酸序列同源性为97.9%～100%，而与参考毒株VP1基因序列的核苷酸序列的同源性为91.7%～95.8%，氨基酸序列同源性为94.5%～98.3%。系统进化树显示共有3个分支，12株DHV分离株均与DHV-Ⅰ处于同一分支，亲缘关系近;而与新型变异株台湾地区株以及韩国株处在不同分支，亲缘关系较远。结果表明试验所分离的DHV毒株为一个群，都属于DHV-I。另试验结果比对分析表明，12株分离株均存在核苷酸和氨基酸的点突变，氨基酸的点突变可以引起病毒抗原性的变化，分析这些点突变有助于研究病毒基因结构中决定毒力的基因位点。而分离株VP1基因核苷酸序列中的某些点突变并没有引起氨基酸的变化，说明病毒表型变化程度低于遗传变异程度[11]。

本研究从基因水平上研究病毒遗传变异情况，分析其基因型，揭示与其他毒株的亲缘关系，为该病在流行病学、亚单位疫苗研制和预防控制方面的研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 邵泽香，韦  强，鲍国连，等.Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J].浙江农业学报，2009，21（5）：434-438.

[2] 何冉娅，于  淼，张玉玲，等.2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析[J].中国动物传染病学报，2010，18（1）：7-15.

[3] SAIF Y M. Diseases of Poultry[M]. 11th Edition. America： Iowa State Press，2003.339-351.

[4] 张艳芳，罗  薇，刘内生，等.鸭肝炎病毒的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38（7）：171-175.

[5] LIU M， ZHANG T T， ZHANG Y，et al. Development and evaluation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus[J]. Journal of Virological Methods.2010，169（1）： 66-69.

[6] OBERSTE M S，MAHER K，KILPATRICK D R，et al.Typing of Human enteroviruses by partial sequencing of VP1[J].J Clinical microbial，1999，37（5）：1288-1293.

[7] 袁率珍，范书才，李  虹，等. 鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]. 中国预防兽医学报，2010，32（11）：849-853.

[8] LI C F， CHEN Z Y， MENG C C，et al. High yield expression of duck hepatitis A virus VP1 protein in Escherichia coli， and production and characterization of polyclonal antibody[J]. Journal of Virological Methods. 2013，191（1）：69-75.

[9] LIU G Q， WANG F， NI Z，et al. Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus type I （DHV-I） isolates from southeast China is related to isolate attenuation[J]. Virus Research，2008，137（1）：137-141.

[10] TSENG C H， TSAI H J. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J]. Virus Research，2007，126（1-2）：19-31.

[11] 邵泽香，韦  强，鲍国连，等.鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析[J].中国兽医学报，2010，30（8）：1052-1055.

（责任编辑  曾德芳）

2.3  VP1基因核苷酸和氨基酸序列比对分析

与参考毒株相比，12株分离株均存在散在点突变现象，氨基酸也存在少数点突变，但没有插入和缺失现象。分离株与参考株的氨基酸序列比对发现，在第49位12株分离株全部为S，与弱毒株A66相同，而强毒株161/79/V为T，推测12株分离株为弱毒株。此外，12株分离株之间也有散在碱基和氨基酸的点突变，在139、214、354、382、471、523、560、577、676 bp位置共有9处碱基位点出现点突变;而氨基酸突变位点有7个，位置在第47、72、128、175、187、193、226位，这些核苷酸和氨基酸位点为研究DHV基因结构中决定毒力的基因位点奠定了基础。12株分离株与DHV-Ⅰ参考株之间的核苷酸变异区域部分图解见图4。

2.4  系统进化分析

用Mega软件对12个分离株和参考株进行系统发育进化树的构建（图5），结果发现，12株分离株与DHV-Ⅰ参考株处于同一个大的分支上，而韩国新型毒株和台湾地区新型毒株分别处于另外两个大的分支，说明12株分离株均为DHV-Ⅰ型。12株毒株分别处于不同小分支，说明分离株之间亲缘关系近，但存在一定的地域差异。

3  小结与讨论

小RNA病毒的结构蛋白VP1基因是病毒抗原性的主要决定成分。DHV-Ⅰ的VP1基因编码的蛋白位于病毒核衣壳表面，能诱导动物产生中和抗体， DHV-Ⅰ VP1基因的核苷酸序列是一个高度可变区，其基因结构和功能仍未明确，分析这个高变区对DHV遗传变异的研究有指导意义[8-10]。

本研究测定的12株I型鸭肝炎病毒VP1基因序列长度为714 bp，编码238个氨基酸。与参考株VP1基因的大小一致，应用DNA Star对所测毒株 VP1基因序列进行了同源性分析，并绘制了系统进化树，结果显示所测得12株DHV分离株的VP1 基因的核苷酸序列同源性为99.2%～100%，氨基酸序列同源性为97.9%～100%，而与参考毒株VP1基因序列的核苷酸序列的同源性为91.7%～95.8%，氨基酸序列同源性为94.5%～98.3%。系统进化树显示共有3个分支，12株DHV分离株均与DHV-Ⅰ处于同一分支，亲缘关系近;而与新型变异株台湾地区株以及韩国株处在不同分支，亲缘关系较远。结果表明试验所分离的DHV毒株为一个群，都属于DHV-I。另试验结果比对分析表明，12株分离株均存在核苷酸和氨基酸的点突变，氨基酸的点突变可以引起病毒抗原性的变化，分析这些点突变有助于研究病毒基因结构中决定毒力的基因位点。而分离株VP1基因核苷酸序列中的某些点突变并没有引起氨基酸的变化，说明病毒表型变化程度低于遗传变异程度[11]。

本研究从基因水平上研究病毒遗传变异情况，分析其基因型，揭示与其他毒株的亲缘关系，为该病在流行病学、亚单位疫苗研制和预防控制方面的研究奠定了基础。

参考文献：

[1] 邵泽香，韦  强，鲍国连，等.Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J].浙江农业学报，2009，21（5）：434-438.

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[3] SAIF Y M. Diseases of Poultry[M]. 11th Edition. America： Iowa State Press，2003.339-351.

[4] 张艳芳，罗  薇，刘内生，等.鸭肝炎病毒的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38（7）：171-175.

[5] LIU M， ZHANG T T， ZHANG Y，et al. Development and evaluation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus[J]. Journal of Virological Methods.2010，169（1）： 66-69.

[6] OBERSTE M S，MAHER K，KILPATRICK D R，et al.Typing of Human enteroviruses by partial sequencing of VP1[J].J Clinical microbial，1999，37（5）：1288-1293.

[7] 袁率珍，范书才，李  虹，等. 鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]. 中国预防兽医学报，2010，32（11）：849-853.

[8] LI C F， CHEN Z Y， MENG C C，et al. High yield expression of duck hepatitis A virus VP1 protein in Escherichia coli， and production and characterization of polyclonal antibody[J]. Journal of Virological Methods. 2013，191（1）：69-75.

[9] LIU G Q， WANG F， NI Z，et al. Genetic diversity of the VP1 gene of duck hepatitis virus type I （DHV-I） isolates from southeast China is related to isolate attenuation[J]. Virus Research，2008，137（1）：137-141.

[10] TSENG C H， TSAI H J. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J]. Virus Research，2007，126（1-2）：19-31.

[11] 邵泽香，韦  强，鲍国连，等.鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析[J].中国兽医学报，2010，30（8）：1052-1055.

（责任编辑  曾德芳）