43～63日龄黄羽肉公鸡铜需要量

李 龙 蒋守群 郑春田 苟钟勇 陈 芳阮 栋 林厦菁

(广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业部华南动物营养与饲料重点实验室广东省动物育种与营养公共实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640)

铜是动物体内必需的微量元素，在许多生化过程中都扮演着重要的角色，铜以酶辅助因子的形式参与体内30多种酶的合成和活化，并且通过酶的活性中心对动物的生长消化、繁殖机能、免疫功能、抗氧化性能以及造血机能产生影响［1-3］，因此研究黄羽肉鸡铜需要量对于提高黄羽肉鸡的生长性能、免疫和抗氧化性能等有重要意义。对肉鸡铜需要量的研究以白羽肉鸡为主［4-8］，周桂莲等［5］在对7～8周龄肉公鸡铜需要量的研究中发现，以生长性能和体铜沉积率为评判指标时，其需要量为10 mg/kg，但是对不同阶段黄羽肉鸡的铜需要量缺乏系统的研究。黄羽肉鸡是我国著名的地方肉鸡品种，因其肉质鲜美、风味独特，在我国肉鸡市场中的占有率愈来愈高。2004年，我国农业部参考我国鸡的饲养标准(1988)和NRC鸡的营养需要(1994)标准制定了《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)。在生产上，有关黄羽肉鸡营养方面的需求参数仍然是沿用白羽肉鸡的饲养标准，该推荐量已经不能满足生产实际上的需要，所以研究适应铜水平对黄羽肉鸡健康生长发育和充分发挥生长潜力尤为重要。本文旨在通过饲养试验，研究饲粮添加不同水平铜对43～63日龄阶段快大型岭南黄羽肉公鸡生长性能、抗氧化性能及血清和肝脏铜含量的影响，从而确定这个生长阶段黄羽肉公鸡铜需要量，为微量元素添加剂的安全有效应用、黄羽肉鸡饲粮的科学配制和黄羽肉鸡饲养标准的修订提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用单因子完全随机设计。选用43日龄快大型岭南黄羽肉公鸡900只，根据体重均衡原则随机分成 6个组，分别饲喂添加 0、4、8、16、32、64 mg/kg铜的饲粮。每个组6个重复，每个重复25只鸡。

1.2 试验饲粮

试验采用纯合基础饲粮，其营养水平参考NY/T 33—2004标准中的黄羽肉鸡营养需要，根据《中国饲粮成分表》(第15版)，计算饲粮配方，参考Okonkwp等［9］的方法选用大豆浓缩蛋白、酪蛋白、葡萄糖、玉米淀粉等配制纯合基础饲粮。组1为对照组，饲喂基础饲粮，铜水平为2.74 mg/kg，组2～6为试验组，在基础饲粮中添加不同水平硫酸铜，使铜水平分别为 6.74、10.74、18.74、34.74、66.74 mg/kg。各组饲粮除铜水平不同，其他营养成分水平基本一致。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成与营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.3 试验动物饲养管理

本试验在广东省农业科学院动物科学研究所动物营养室试验场进行。由广东省农业科学院动物科学研究所智威农业科技股份有限公司购入1日龄健康、发育良好的岭南快长型黄羽肉鸡公雏，根据我国黄鸡饲养标准配制饲粮饲养，1～42日龄所有鸡统一饲喂，1～21日龄饲粮铜水平为2.80 mg/kg，22～42 日龄饲粮铜水平为2.75 mg/kg(表1)。43日龄时，根据体重均衡原则试鸡随机分组饲养，43～63日龄饲喂不同铜水平饲粮，具体分组方法按照试验设计进行。试鸡采用网上平养，自由采食与饮水。其他按常规饲养操作规程进行。

1.4 测定指标与方法

试验全期，每天仔细观察鸡群的精神状态、食欲、粪便、缺乏症、死亡等情况，记录试验各组雏鸡的死亡数，并对病死鸡逐只进行病理剖检，查明死因。

试验结束时，根据平均体重选取试鸡2只翅静脉采血约10 mL，在室温下倾斜放置30 min后，3 500 r/min离心10 min，分离血清于-20℃保存待测。剖摘肝脏、双侧胸肌，做好标记，-20℃保存待测。

1.4.1 生产性能

饲养期间以重复为单位，记录每天的采食量。在试验结束前1天22:00断料供水，于次日清晨以重复为单位称鸡空腹重、结料，计算平均日增重、平均日采食量和料重比，记录死亡数，计算死亡率。

1.4.2 血清和肝脏铜含量

血清铜含量采用火焰原子吸收光谱仪(SpectrAA-50/55型，美国瓦里安公司)测定，操作步骤为:取200μL血浆于100 mL烧杯中，加5 mL浓硝酸(优级纯)，盖上表面皿，置于电热板上消煮至澄清透明，待消煮过的样品冷却后用去离子水定容至10 mL，摇匀后测定铜含量;肝脏铜含量测定同血清铜含量测定方法。

1.4.3 抗氧化指标

血清、肝脏、胸肌中的铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-superoxide dismutase，CuZn-SOD)活性采用紫外可见分光光度计(Biomate-5型，美国热电公司)测定;血清、肝脏、胸肌中的过氧化产物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法在紫外可见光分光光度仪上测定;血清中铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)活性用酶标仪(SprctrsaMax-5型，美国瓦里安公司)按照联大茴香胺法测定;肝脏中金属硫蛋白(metallothionein，MT)含量用酶标仪按照镉血红蛋白亲和力分析法测定［10］。以上所用的分析试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，样品处理方法按照试剂盒内说明书步骤操作。

1.5 数据处理与统计

试验数据采用SAS 8.2软件的GLM程序进行方差分析并进行多项式线性和二次曲线分析。统计显著性水平为 P＜0.05，极显著性水平为 P＜0.01。各组试验数据均以平均值±标准误(mean±SE)表示。对相关敏感指标平均日采食量和肝脏CuZn-SOD活性分别拟合折线和二次曲线等不同的数学模型，然后根据拟合度选择拟合最佳的模型，用以确定黄羽肉公鸡铜需要量。其中，对平均日采食量和肝脏CuZn-SOD活性指标采用Baker等［11］和 Robbins等［12］的方法，运用 SAS 软件的REG程序和NLIN程序建立二次曲线方程(Y=AX2+BX+C，X＜X0;Y=AX20+BX0+C，X≥X0。式中:Y代表平均日采食量或肝脏CuZn-SOD活性，X代表饲粮铜水平，A和B分别代表方程二次项和一次项的系数，C代表方程的常数项，X0代表拐点所对应的饲粮铜水平，即为黄羽肉公鸡铜需要量)与单斜率折线性方程(Y=AX+B，X＜X0;Y=AX0+B，X≥X0。式中:Y代表平均日采食量或肝脏CuZn-SOD活性，X代表饲粮铜水平，A代表斜率，B代表截距，X0代表拐点所对应的饲粮铜水平，即为黄羽肉公鸡铜需要量)。

2 结果与分析

2.1 饲粮铜添加水平对43～63日龄黄羽肉公鸡生长性能的影响

由表2可知，饲粮添加不同水平铜对料重比没有显著影响(P＞0.05);16、32、64 mg/kg 铜组试鸡末重显著高于对照组和4 mg/kg铜组(P＜0.05)，而与 8 mg/kg 铜组差异不显著(P＞0.05);16、32 mg/kg铜组试鸡平均日增重显著高于对照组和4 mg/kg铜组(P＜0.05)，而与其他组差异不显著(P＞0.05);16、32 mg/kg铜组试鸡平均日采食量显著高于对照组(P＜0.05)，而与 4、64 mg/kg铜组比较则差异不显著(P＞0.05)。

表2 饲粮铜添加水平对43～63日龄黄羽肉公鸡生长性能的影响Table 2 Effects of dietary copper level on growth performance of male yellow-feathered broilers aged from 43 to 63 days of age

2.2 饲粮铜添加水平对63日龄黄羽肉公鸡血清、肝脏铜含量的影响

由表3可知，饲粮添加不同水平铜对血清中铜的含量影响不显著(P＞0.05);8、16mg/kg铜组试鸡肝脏中铜含量显著低于对照组、4 mg/kg铜组(P＜0.05)，16 mg/kg 铜 组 还 显 著 低 于 32、64 mg/kg铜组(P＜0.05)。

表3 饲粮铜添加水平对63日龄黄羽肉公鸡血清和肝脏铜含量的影响Table 3 Effects of dietary copper level on copper content in serum and liver of male yellow-feathered broilers at 63 days of age

2.3 饲粮铜添加水平对63日龄黄羽肉鸡血清、肝脏、胸肌抗氧化指标的影响

由表4可知，饲粮铜添加水平对血清中MDA含量的影响不显著(P＞0.05);16、32 mg/kg铜组试鸡血清CuZn-SOD活性显著高于对照组、4和8 mg/kg铜组(P＜0.05)，而与 64 mg/kg 铜组比较则差异不显著(P＞0.05);16、32、64 mg/kg 铜组试鸡血清铜蓝蛋白活性显著低于对照组、4和8 mg/kg铜组(P＜0.05)。饲粮添加不同水平铜对肝脏中MDA和MT的含量影响不显著(P＞0.05);32、64 mg/kg 铜组试鸡肝脏中 CuZn-SOD活性显著高于其他组(P＜0.05)，而其他组之间差异不显著(P＞0.05)。饲粮添加不同水平铜对试鸡胸肌 CuZn-SOD活性无显著影响(P＞0.05);32、64 mg/kg铜组的胸肌MDA含量显著低于其他组(P＜0.05)，而与其他组之间则差异不显著(P＞0.05)。

表4 饲粮铜添加水平对63日龄黄羽肉鸡血清、肝脏、胸肌抗氧化指标的影响Table 4 Effects of dietary copper level on antioxidant indices in serum，liver and chest muscle of male yellow-feathered broilers at 63 days of age

2.4 43～63日龄黄羽肉公鸡饲粮铜需要量的估测

如表5所示，若作二次折线方程预测，当以平均日增重为效应指标时，该阶段达到最佳平均日增重时的铜需要量为 30.98 mg/kg;当以CuZn-SOD活性为效应指标时的铜需要量为57.72 mg/kg。若作单斜率折线方程预测，当以平均日增重为效应指标时，该阶段达到最佳平均日增重时的铜需要量为19.94 mg/kg;当以 CuZn-SOD活性为效应指标时的铜需要量为38.34 mg/kg。

表5 折线回归模型估测铜需要量Table 5 Copper requirement estimated by broken-line regression

3 讨 论

3.1 饲粮铜添加水平对43～63日龄黄羽肉公鸡生长性能的影响

关于不同饲粮铜水平对肉鸡生长性能的影响，不同研究者得出的结论不一致。周桂莲等［5］、申爱华等［6］研究认为，肉仔鸡后期饲粮铜添加量为10 mg/kg左右其生长性能最佳。常新耀等［13］、张春善等［14］进行的肉仔鸡微量元素添加剂配方生产效果的验证试验报道，配制饲喂玉米-豆粕型饲粮时，在饲粮时添加铜8 mg/kg(CuSO4·5H2O)，可满足最佳生长性能需要。本试验结果表明，饲粮添加铜能显著改善43～63日龄黄羽肉鸡的生长性能，当饲粮添加铜水平为16 mg/kg(总铜为18.74 mg/kg)时，肉鸡的末重、平均日增重、平均日采食量最大。造成以上研究结果不一致的原因可能与试验的饲粮类型及肉鸡品种、日龄、饲粮等不同有关。本试验所用饲粮是纯合饲粮，基础饲粮中铜含量比玉米-豆粕型饲粮低，故添加水平可能就相对较高才能满足需要，再加上快大型黄羽肉鸡与白羽肉鸡不同生理结构和特性，其铜添加水平对生长性能影响也不同。

3.2 饲粮铜添加水平对43～63日龄黄羽肉公鸡血清、肝脏铜含量的影响

研究表明，随着饲粮中铜水平的升高，血清中铜的含量增高［15-16］。但是本试验结果表明，随着饲粮中铜水平的升高，血清中铜的含量差异不显著。也有研究表明，血清铜含量在膳食铜水平达到某一临界值时才会发生可检测的变化［17］，摄食铜缺乏或不同铜水平饲粮的动物血浆铜含量没有显著差异，这可能是由于血液中铜含量受动物体内存在强大的体内平衡机制调控，从而维持内环境血浆铜含量相对恒定［18-19］;并且动物对一定范围内饲粮中的高铜具有通过增加胆汁中的铜排泄来保持铜平衡的能力［20］，而本试验设计的铜的梯度范围可能恰好在黄羽肉鸡血清铜体内平衡机制调控之内，所以血清铜含量差异不显著，但是具体机理还需要进一步研究。

肝脏是体内铜的重要贮存和代谢器官，肝脏铜含量能反映体内铜的状态［2，20-21］。有研究表明随饲粮铜水平提高，肝脏铜含量增加［2，22-23］，但是本试验结果表明随着饲粮铜水平的提高，肝脏铜含量并不显著增加。也有研究表明临界缺乏的低铜状态下机体能通过加强肝脏铜的蓄积以平衡或满足铜的需要［24］，一定剂量和时间范围内的饲粮高铜能有效地促进肝脏铜的蓄积，但当肝脏铜的蓄积量达到饱和时，继续增加饲粮铜含量则导致肝脏铜迅速大量地释放，肝脏铜含量降低，并维持在相对稳定的低水平状态［25-26］。本试验结果表明，饲粮铜水平在 2.74和 6.74 mg/kg时，肝脏铜含量差异不显著;但饲粮铜水平在 10.74和18.74 mg/kg时，肝脏铜含量显著降低;饲粮铜水平在34.74和66.74 mg/kg时，肝脏铜含量也有降低的趋势，因此说明黄羽肉鸡在肝脏铜的蓄积量达到饱和时，肝脏铜含量降低，但是其中具体的机理还需要进一步研究与验证。

3.3 饲粮铜添加水平对43～63日龄黄羽肉公鸡抗氧化性能的影响

铜的生理功能之一是抗氧化作用，铜能参与到抗氧化防御系统中，影响自由基和改变抗氧化酶与底物的状态，铜严重缺乏或过量都会引起病变，包括许多血浆和组织中含铜酶等生化指标的显著变化［27］。

CuZn-SOD是最常见的抗氧化酶之一，也是机体内超氧自由基的主要清除剂，对于维持生物膜的完整性，机体免疫功能，动物健康都有非常重要的作用。在调节CuZn-SOD功能活性的表达中铜较锌起着更主要的作用，铜作为CuZn-SOD的辅助因子，Dameron等［28］报道幼年生长动物主动脉中的CuZn-SOD活性受到饲粮中铜水平的调节，当动物饲粮缺铜时，可降低其许多组织中CuZn-SOD的活性［29］，并且CuZn-SOD活性随饲粮铜水平的升高显著提高［30］。本研究饲粮添加不同水平铜显著提高了血清和肝脏里CuZn-SOD的活性，这与上述结果一致，但是胸肌里的CuZn-SOD的活性无差异，这表明在本试验条件下，不同铜水平对胸肌该氧化酶的活性没有调节作用。

铜蓝蛋白可作为超氧阴离子的清除剂，能抑制通过黄嘌呤氧化酶调节的正铁细胞色素C的还原作用，以减少此过程中诱发的超氧阴离子自由基的生成，具有类似CuZn-SOD的作用［31］，铜蓝蛋白主要由肝脏合成，然后随血液循环在身体各处发挥作用［32］。许多研究证实，饲粮中添加铜可提高铜蓝蛋白的活性［33-34］。但也有研究表明铜蓝蛋白活性随饲粮铜水平的增加而升高，但当饲粮铜水平达到一定剂量(过量剂量)时，铜蓝蛋白活性显著下降［35-37］，并且因为肝细胞内质网中合成的脱铜铜蓝蛋白与吸收肝脏中的铜离子结合形成血浆铜蓝蛋白，随后被分泌入血浆［20］，所以血浆中铜蓝蛋白和肝脏铜含量有一定联系。本试验结果表明，与对照组相比，随着饲粮中铜水平升高未出现肝脏铜蓝蛋白的活性显著升高的情况，反而是达到铜水平达到18.74 mg/kg后铜蓝蛋白活性显著下降，说明可能已经到达过量剂量，并且铜水平达到18.74 mg/kg后，肝脏铜含量下降或者有下降的趋势，说明铜蓝蛋白和肝脏铜含量在一定程度具有关联性，这也与何霆等［38］的研究结果一致，但是具体的机理还需要进一步研究与验证。

MT在体内主要与铜和锌结合，组织中MT浓度受锌和铜状态的影响，当锌水平稳定时，铜的摄取速度超过了细胞内铜的清除能力而发生铜沉积时，将诱导大量MT合成，而铜缺乏时，肝脏MT的代谢也会发生改变［39］。本试验研究表明，饲粮不同水平铜对试鸡肝脏中MT的含量无影响，这可能是由于动物机体内铜摄取速度和细胞内铜的清除能力能保持一种动态平衡［40］，从而使肝脏中的MT含量没有显著变化，但是具体的机理还需要进一步研究与验证。

MDA是脂质过氧化降解的主要产物，其含量反映了体内脂质过氧化的氧化程度及细胞受自由基攻击的程度。测定MDA的含量可反映机体内脂质过氧化强弱，间接反映机体氧化损伤的程度［41-42］。本试验结果表明，饲粮中不同水平的铜对血清和肝脏中MDA含量也无显著影响，说明血清和肝脏中的脂质过氧化物的生成量在该铜水平范围内较稳定。但是随着铜水平提高一定程度却能降低胸肌里的MDA含量，说明随着铜水平的提高，可降低胸肌里的过氧化物的生成量。

3.4 黄羽肉公鸡铜需要量的探讨

研究畜禽营养素需要量的方法多种多样，传统营养学上常采用剂量反应法研究畜禽营养素需要量，但随着统计知识和SAS软件的开发应用，越来越多的学者采用建立合适的数学模型这一方法来描述和预测畜禽对营养素的需要量和反应［11-12］。评定营养需要量时，随着饲粮铜水平的增加，反应指标要达到一个平台期，即不再有显著意义上的增加或降低［43］。根据这一定义，本试验适宜评价铜营养需要量的指标为平均日增重、平均日采食量、血清和肝脏中CuZn-SOD活性和胸肌中MDA含量。本试验通过方差分析、多重比较结果和折线拟合后的结果，以平均日增重、平均日采食量、血清和肝脏中CuZn-SOD活性和胸肌中MDA含量适宜作为评价指标，43～63日龄黄羽肉公鸡铜需要量分别为18.74和34.74 mg/kg;由表5可知选用的2种折线回归模型中平均日增重和肝脏CuZn-SOD活性的回归系数以单斜率折线方程的R2值最大，说明该阶段平均日增重和肝脏CuZn-SOD活性比较符合单斜率折线方程，通过其回归模型以平均日增重、肝脏中CuZn-SOD活性估测的43～63日龄黄羽肉公鸡铜需要量分别为19.94 和 38.34 mg/kg。

国内外有关肉鸡的铜需要量的大部分接近于NRC(1994)和黄羽肉鸡饲养标准(2004)的推荐量 8 mg/kg［4-6］，Feedstuffs 的 推 荐 标 准 是11 mg/kg［4］。从本试验结果来看，43～ 63 日龄黄羽肉公鸡获得最佳生长性能和抗氧化功能的铜需要量分别为18.74和 34.74 mg/kg，通过折线回归模型以平均日增重、肝脏中CuZn-SOD活性估测的饲粮铜需要量分别为 19.94和 38.34 mg/kg，都高于 NRC鸡的营养需要(1994)和 NY/T 33—2004标准中黄羽肉鸡铜营养需要的推荐量(8 mg/kg);这可能与鸡的品种和评价指标不同有关。研究表明黑色素和褐色素的相对数量与分布决定了动物被毛表现出从白至黑多种毛色［44］，其中起最重要作用的就是络氨酸酶，铜含量的多少直接影响酪氨酸酶的活性，并且酪氨酸酶能氧化酪氨酸形成黑色素和形成褐色素的前体物质，进而影响毛色［45-46］;由于黄羽肉鸡羽毛比白羽肉鸡羽毛色素沉积量更高，这就有可能需要更多的酪氨酸酶，所以就表现出黄羽肉鸡比白羽肉鸡铜需要量高;其次NRC选用以生产性能为评价指标，而本试验以生长性能和抗氧化性能为评价指标，这种评判指标不同也能造成需要量差异;因此，生产中应根据鸡的品种和评判指标对肉鸡铜添加量做适当调整。

由于本试验结果中铜需要量远高于NRC鸡的营养需要(1994)和NY/T 33—2004标准中黄羽肉鸡铜营养需要的推荐量，有可能造成粪便铜排放增多从而对环境造成污染，因此对粪便铜含量进行的检测和对有机铜替代无机铜减少铜排放是下一步研究的重点。

4 结 论

在本试验条件下，以生长性能和抗氧化性能为评定指标，43～63日龄快大型黄羽肉公鸡铜需要量分别为 18.74、34.74 mg/kg;而通过折线回归模型以平均日增重、肝脏中CuZn-SOD活性估测的铜需要量分别为 19.94 和 38.34 mg/kg。

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