猪源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及药敏试验

文│王翠霞 车小平（甘肃省临夏市畜牧技术推广站）

猪源多杀性巴氏杆菌病引起慢性猪巴氏杆菌性肺炎和猪肺疫，又称“锁喉风”急性感染以败血症和出血性炎症为主要特征，其慢性感染以关节、皮下结缔组织及脏器化脓为主要特征。本病由被感染病猪分泌物排泄物散毒后经消化道进行传播，在季节交替、气候多变的时候多发，一般呈地方流行性。本菌分型复杂，地区差异性较大，在动物防疫工作带来极大的困难。本研究从某地区疑似巴氏杆菌感染的病、死猪肺脏组织中分离出4株由生化鉴定为巴氏杆菌，对细菌作药物敏感试验以了解本地区猪巴氏杆菌的耐药情况，为今后防治本病提供依据。

一、材料和方法

1.病料来源。从某地发生呼吸道疾病，经临床初诊为猪肺疫的规模化猪场采集12只病、死猪的肺脏组织、淋巴结等病料组织进行试验。

2.主要试剂。营养琼脂、LB肉汤、大豆酪蛋白琼脂、血琼脂平板；细菌微量生化鉴定管（氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、果糖、蔗糖、脲酶等生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司）；药敏纸片，及其他分析醇试剂。

3.实验方法。

（1）病料镜检：将病变严重的部位涂片后进行革兰氏染色和瑞氏染色，油镜下观察细菌形态。

（2）细菌分离：无菌采集疑似病死猪的新鲜病料后取病变典型部位，进行组织匀浆后接种于LB肉汤中37℃震荡培养24小时后涂布大豆酪蛋白琼脂（TSA）培养基，37℃培养24小时，观察菌落生长情况，挑取可疑菌落进行染色镜检、分离纯化。

（3）生化鉴定：将分离纯化后的细菌液体培养后接种于各种碳水化合物、尿素酶、糖苷等微型生化鉴定管中，37℃培养24～48小时观察结果，同时做氧化酶和接触酶实验。

（4）药敏试验：吸取细菌液体物200微升反复均匀涂布于TSA培养基上，待干燥后将庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星等20种常规药敏纸片贴放在培养基表面置于37℃培养24～48小时，观察抑菌圈的大小记录结果。判断标准为药物敏感试验抑菌环直径判断标准（WS/T125-1999）。

二、结果

1.细菌分离鉴定。病料组织涂片镜检和疑似菌分离纯化后，单个菌落抹片后镜检，瑞氏染色可见典型的两极深染的短杆状细菌；革兰氏染色发现有散在的革兰氏阴性球杆状或短杆状细菌，偶见成对存在。

细菌在TSA培养基上生长良好，形成圆形、不透明、表面光滑、湿润的露滴样菌落；血琼脂平板上生长良好，但是不溶血；营养琼脂上不生长。

2.生化试验鉴定结果（表1）。将分离纯化后的4株疑似菌落编号为①、②、③、④，接种于微量生化管进行生化试验鉴定，结果和第八版《伯杰细菌鉴定手册》中描述一致，初步判定为多杀性巴氏杆菌。

3.药敏试验。对分离纯化后的4株经生化鉴定为巴氏杆菌的菌株分别进行药物敏感试验，测得各分离株对药敏纸片的抑菌圈大小并取平均值进行判定，4个菌株均对β-内酰胺类和大环内酯类抗生素很敏感，对磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、林可胺类和氯霉素类抗菌药物具有一定的耐药性；对四环素类和硝基呋喃类抗菌药物高度耐药，详见表2。

三、讨论

本研究经过试验从疑似病料组织中分出了4株多杀性巴氏杆菌，经革兰氏染色镜检为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌，以散在分布为主，偶见成对；经瑞氏染色镜检可见两极着色深，中间染色浅的小短杆菌。细菌在TSA培养基上生长良好，在鲜血琼脂上生长良好无溶血现象，在营养琼脂上几乎不生长。经生化试验鉴定该菌能够发酵果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、D-山梨醇、D-甘露醇产酸。

近年来，由于抗生素滥用和残留等因素导致细菌普遍存在复杂的耐药性现象，不同地区感染相同的病原菌其药物敏感性却各不相同，这一结果与当地临床上的用药习惯有关，因此遇到传染病发生时不能盲目使用抗生素类药物，通过药敏实验筛选效果较好，对病原微生物敏感的抗菌药物有针对性地进行治疗才能达到控制病情的目的。根据药物敏感试验证实本次分离纯化的4株猪源多杀性巴氏杆菌对β-内酰胺类和大环内酯类抗生素很敏感，对磺胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、林可胺类和氯霉素类抗菌药物具有一定的耐药性；对四环素类和硝基呋喃类抗菌药物高度耐药；为发病猪场多杀性巴氏杆菌病的治疗和预防提供依据，可以采用氨苄青霉素、棒酸、阿奇霉素、先锋霉素、螺旋霉素等药物。

表1 分离纯化后细菌生化试验结果

表2 药物敏感试验结果

目前对于临床上流行的猪巴氏杆菌病最有效的控制措施仍为抗菌药物，但是由于菌体普遍存在抗生素耐药的结局，因此我们在该地区防控巴氏杆菌病时主要从传染病传播的三要素进行，一为控制传染源，对本地区巴氏杆菌流行的养殖场进行彻底的消毒灭源，使用2%来苏尔、3%福尔马林、3%石炭酸等巴氏杆菌敏感的消毒药物对病猪污染的圈舍、饲草料、用具、车辆等进行彻底的消毒；二为保护易感动物，一旦发现畜群中有发病的情况，对接触过病猪的疑似猪和健康猪进行彻底的隔离。

多杀性巴氏杆菌的血清分型根据荚膜K抗原分为A，B，D，E和F 5个血清型，根据O抗原的差异分为12个血清型，根据耐热抗原差异分为16个菌体型。对于巴氏杆菌病来说最好的预防措施为注射疫苗，但是由于其血清型较多，各血清型之间交叉免疫保护作用较弱，市场上购买的疫苗往往起不到预防作用。因此笔者建议将分离出的巴氏杆菌扩大培养后制作灭活自家苗，可以有效地预防巴氏杆菌病在本地区的流行。