传染性支气管炎病毒分子生物学的研究进展

文│宋会臻（山东省潍坊市临朐县畜牧局）

传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，以气管啰音、咳嗽、呼吸困难等呼吸道症状和肾脏肿大苍白、肾小管和输尿管尿酸盐沉积等泌尿生殖道病变为主要特征。另外该病还可以使蛋鸡产蛋量和产蛋品质下降，给养鸡业造成巨大的经济损失。

1930年在美国首先发现了IB，1931年Schalk和Hawn正式报道了该病，1936年Beach和Schalm确定了该病的病原，1937年Beaudette和Hudson首次利用鸡胚成功培养了IBV，1956年Jungherr等证明了IB病原不止一个血清型，1962年Winterfield和Hitchner发现了肾病变型IB，1972年中国邝荣禄首次发现了该病，1988年中国分离出了肾型IBV。迄今，世界各地仍不断出现关于IBV血清型毒株的报道。IBV传播速度快，潜伏期短，加上鸡场集约化养鸡的密集和肾型、腺胃型、嗜肠型新变异株的出现，给我国养鸡业带来了新的威胁。现就病毒的生物学特性、基因组结构、病毒变异、分子生物学诊断等方面作一综述。

一、病原学及生物学特性

传染性支气管炎病毒（IBV）为有囊膜的单股正链RNA病毒，多数呈圆形或椭圆形，直径约120纳米，表面有长约20纳米的杆状纤突。IBV对热和0.2%去氧胆酸钠、0.01%高锰酸钾溶液高度敏感，其在-30℃以下可以存活24年，在56℃15分钟或45℃90分钟即可灭活，在质量分数为0.01% 高锰酸钾、1%的来苏尔、1%福尔马林、2%氢氧化钠溶液中3分钟即可被灭活。IBV对乙醚、氯仿等有机溶剂敏感。病毒在PH＝7.8时稳定性较好。多数IBV表面没有凝集原，本身不能直接凝集红细胞，但经过磷脂酶等处理后可具有凝集红细胞的活性，这一活性能被特异性抗血清所抑制。目前，人们可利用IBV的血凝活性鉴定毒株和检测抗体。鸡IBV能干扰新城疫病毒（NDV）在雏鸡、鸡胚和鸡肾细胞内的增值，利用IBV的这一生物学特性，可将NDV干扰试验作为鉴定IBV的方法之一。

二、基因组结构

IBV属冠状病毒科冠状病毒属，是长约27千碱基对（Kb）的单股正链RNA病毒。在病毒基因中至少有10个明显的开放阅读框（ORF），编码分子量为6.7～440道尔顿（KD）的蛋白，即结构蛋白和非结构蛋白。IBV被分为6个区域，由小到大分别被命名为mRNA A～F。IBV有3种主要结构蛋白：纤突蛋白（S）、膜蛋白（M，又叫基质蛋白）、核衣壳蛋白（N）。这三种蛋白分别是由mRNA E、C、A编码，其蛋白的摩尔比分别是1∶6∶15。另外，还有极少量的与病毒囊膜有关的小膜（E）蛋白。且不同蛋白的功能有所不同。

1.纤突蛋白（S）。S蛋白是决定IBV抗原性的主要结构蛋白。该蛋白是病毒杆状纤突的主要组成部分，也是病毒最重要的保护性抗原。S蛋白有S1和S2两种糖多肽，S1糖蛋白的分子量约为90KD，由520～538个AA组成；S2糖蛋白的分子量约为84KD，由625个AA组成。在所知的IBV基因序列中，S蛋白的裂解位点都是保守的，它是由S1的N端和S2的C端通过二硫键连接而成。两种糖蛋白中S1糖蛋白是形成S蛋白的主要部分，也是IBV基因组发生变异的主要部位。当基因发生突变和重组时，S1蛋白表面的抗原决定簇的构象就会发生变化，随之IBV就会出现新的变异株。S蛋白有多种生物学功能：可诱导机体产生IBV特异性中和抗体（VN）、血凝抑制抗体（HI）；S蛋白与宿主细胞膜上糖蛋白受体的结合，使IBV吸附在宿主细胞上，只有S蛋白被宿主细胞的蛋白酶切割为S1和S2两条多肽时，病毒囊膜才有融细胞的活性；S1蛋白氨基N端可决定病毒毒株的组织嗜性和毒力情况；S1蛋白还可决定IBV的血清型；S2蛋白可诱发较弱的中和抗体，其在大多数IBV毒株中是保守的，可作为IBV疫苗。

2.膜蛋白（M）。M蛋白的分子量约为30KD，由225个氨基酸（AA）组成。该蛋白占病毒总蛋白的40%左右，大部分M蛋白AA镶嵌在病毒囊膜上或内膜的表面，只有10%左右的AA裸露在膜的外表面。它可以控制并介导病毒粒子在粗面内质网或高尔基体膜上的出芽，病毒装配时与核衣壳的相互作用，核衣壳结合囊膜的作用。M蛋白在3种主要结构蛋白中的免疫原性相对较低，然而在补体存在的前提下，抗M蛋白抗体可以中和病毒抗原。总之，M蛋白在病毒免疫学方面的功能还需要进一步的探索。

3.核衣壳蛋白（N）。N蛋白是病毒核衣壳的组成蛋白，分子量约为46KD，由409个AA组成。N蛋白是IBV相对稳定和较保守的基因，研究表明，N蛋白在IBV的检测、RNA的合成、血清学分类、免疫的识别、细胞免疫与体液免疫中有重要的作用，特别是对核酸疫苗的研制具有重要意义。N蛋白在IBV三种主要结构蛋白中含量甚多，具有很强的抗原性，因而该蛋白在IB的预防和控制中起关键作用。

4.小囊膜蛋白（E）。E蛋白分子量约为12.4KD，其与M蛋白协同作用，形成病毒样颗粒（VLP），后者在IBV的黏膜免疫中发挥功能。在病毒的复制过程中，E蛋白参与VLP形成和病毒出芽，近来又发现E蛋白在IBV感染后期的细胞中非常丰富，推测该蛋白与细胞凋亡有关。

三、基因变异

IBV的变异有基因的点突变、基因的缺失、基因的替代、基因的插入和基因的重组，其中基因的突变和重组是IBV不断出现新的血清型和变异株的主要原因。IBV的遗传物质RNA不稳定较易降解；IB RNA病毒的复制缺乏像DNA病毒复制过程中DNA聚合酶那样的校对功能；IBV基因组较长，每个复制循环大约可以产生3个突变，突变的随机性使IBV分子不能维持均一性，这些使IBV具有高变异的特点。IBV的抗原变异部位主要在S蛋白上。有研究表明，S蛋白在50～170位AA和250～310位A A 处易发生碱基的替代，在120～170AA处易发生碱基的插入或缺失。Gavanagh研究表明，S1蛋白易在37～140位AA和269～365位AA处发生变异。Sapals研究表明，S蛋白易在59～313位AA处发生碱基的变异。简而言之，大部分IBV血清型抗原决定簇在S1 N端的前300个AA残基内。

IBV不断产生新的变异株的原因除了S1基因的突变外，还有野毒株之间、疫苗之间、野毒株和疫苗之间的基因重组。Kusler研究表明，日本KB8523分离株是由M41和D1466重组获得，英国6/82分离株是由D207和D1466重组获得。

四、分子生物学诊断技术的研究

用逆转录-聚合酶链反应（RTP C R）和限制性片段长度多态性（RFLP）方法鉴别诊断IBV毒株的方法已有报道，该方法是用PCR扩增编码IBV抗原决定簇的基因，用限制性内切酶消化产物、电泳，最后根据酶切图对病毒进行分型。该分类方法新颖、重复性好，且对病毒从分子水平上进行了分析，但电泳图较复杂，难以分析，实际应用局限性较大。Kwon研究提取了S1基因，RT-PCR和RFLP的结果与中和试验的结果基本一致。

单克隆抗体检测技术（McAb）是IBV研究的一样新的技术。它检测表面抗原决定簇。该方法具有针对单个抗原决定簇的高效特异性、敏感性，通过与基因定序、基因重组等技术的结合，可将保护性抗原定位到基因的水平。

核酸探针技术是利用特异性核酸探针与PCR扩增的待检病毒样本片段杂交。如果两者结合，X底片就会显影；反之不显影。该方法敏感、特异、快速。Kwon应用PCR和生物素标记的DNA探针检测了接种IBV的无特定病原（SPF）鸡气管中的IBV基因组，证实此法比电镜（EM）观察病毒法要灵敏。Jackwood用该技术检出了最小IBV cDNA量为125纳克。地高辛标记IBV pol基因的保守片段制成核酸探针的实验结果表明，用此法检测到的RT-PCR产物，特异性和敏感性强，可重复，能克服RT-PCR非特异性反应和探针Northen 杂交的不稳定性。Brown用P32标记IBV cDNA检测病毒的RNA，结合斑点杂交和放射性自显影检测到了血清中和抗体试验所不能检测到的病毒抗原。利用核酸探针的特异性，用IBV蛋白基因设计引物，检测结果稳定性好，重复性好，且不需要特殊的设备。核酸探针技术适宜基层对IBV的诊断和流行病学的调查。

寡聚核苷酸序列图谱分析主要用于IBV流行病学的调查。Kusters等人从纯化的IBV中提取核酸，T1酶消化后用P32标记进行双向电泳，自显影后根据图谱上相应斑点的有无进行分析。该方法重复性和敏感性好，但要求基因序列的同源率大于95%。实际应用中，一般把寡聚核苷酸序列图谱分析方法和其他方法相结合进行IBV的诊断。

五、小结

文章从鸡传染性支气管炎病毒病原学、基因组结构、基因变异、分子生物学诊断等方面进行了对比分析，以文献综述的形式介绍了近年来鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究状况。IBV的分子生物学研究虽然取得了很大的进展，但对该病毒蛋白的结构与功能、病毒基因变异与重组机理、疫苗的研制等方面尚不十分清楚，有待人们进一步研究。相信随着IBV分子生物学的深入研究和基因工程疫苗的不断改进，这些问题将被一一解答。