胰高血糖素样肽－1可改善高糖环境下人脐静脉内皮细胞的氧化应激

王丽静，陈丽云，刘晓红，陈 洲，刘礼斌

2.福建医科大学 药学院，福州 350108

糖尿病血管并发症是糖尿病致死致残的主要原因，而内皮细胞功能紊乱是糖尿病心血管疾病发生的始动环节[1]。高血糖是最重要的刺激因素，大量研究表明，其作用机制与诱导机体氧化应激密切相关[2－3]。氧化应激是自由基引起的一种负面效应，其自由基主要包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮和亲电子体等。机体的抗氧化防御机制主要成分包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－PX）等，其中SOD是抗氧化防御的第一线。

胰高糖素样肽－1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）是近年来糖尿病研究领域的热点，因其可促进胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌而用于糖尿病的临床治疗中。此外，研究发现GLP－1对内皮细胞功能亦有保护作用[4]，但其机制尚不清楚。本研究观察GLP－1对高糖培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical veine ndothelial cells，HUVECs）功能的作用，并进一步探讨其对氧化应激相关指标变化的影响，以期为更好地理解GLP－1的糖尿病心血管保护作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 脐带标本采自福建医科大学附属协和医院健康孕妇剖腹产后，立即对HUVECs进行分离培养。

1.1.2 试剂 M199培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司），内皮细胞生长添加剂（美国BD公司），GLP－1（7－36）（美国 Sigma公司），胶原酶Ⅰ（美国Invitrogen公司），SOD活力检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒、NO（DAF－FMDA探针法）检测试剂盒（杭州碧云天生物技术研究所）。

1.1.3 仪器 二氧化碳培养箱（MCO－15AC，日本SANYO公司），荧光酶标仪（Thermo scientific公司），倒置显微镜（CKS41，日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代 HUVECs的分离、培养 取当天剖腹产新鲜脐带10～15cm，洗净脐带表面的残留血液，无菌手术刀片部分切除其一端，辨别脐带静脉，以双抗PBS充分冲洗脐静脉至流出液体中无血性液体，灌入0.1%胶原酶Ι在37℃条件中消化15min。消化结束后PBS冲洗脐带，收集消化液离心后弃上清，加入4mL 10%M199培养基悬浮细胞，接种到塑料培养瓶中，37℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养。每2～3d换液1次，当细胞生长融合达80%～90%时，消化、传代接种于培养板上。

1.2.2 人脐静脉内皮细胞鉴定 取生长良好的第三代细胞按105mL－1细胞密度接种于6孔培养板中，培养24h。以4%多聚甲醛中固定，PBS清洗后加入0.5%Triton X－100破膜处理，加入3%H2O2室温浸泡20min；5%BSA封闭20min。滴加兔抗人Ⅷ因子抗体，置于湿盒中4℃过夜。滴加山羊抗兔二抗（HRP标记），37℃孵育20min。将DAB显色剂混匀后加至爬片，室温避光显色，当胞质中出现棕褐色颗粒时终止显色，蒸馏水冲洗干净。苏木素精复染2min。脱水，透明，封片，显微镜观察拍照。

1.2.3 实验分组 将 HUVECs细胞分为：对照组，不做任何处理；高糖组，30mmol／L D－葡萄糖培养；GLP－1预处理组，先加入GLP－1 100nmol／L预处理1h，后以30mmol／L D－葡萄糖培养7d。

1.2.4 乳酸脱氢酶释放检测细胞毒性定量分析细胞按1.2.3实验组别进行分组干预。干预结束后，取细胞上清液。将120μL待检样本及60mL LDH检测工作液（乳酸溶液、INT溶液、酶溶液按1∶1∶1）混匀，室温孵育30min；酶标仪下测定吸光度（使用490nm和620nm双波长测定）；按公式：

计算评价细胞毒性情况。

1.2.5 荧光酶标仪检测ROS水平 细胞按1.2.3实验组别进行分组干预；各组加入适量DCFH－DA 10μmmol／L于培养基中，37℃避光孵育30min。加入胰酶消化后制备细胞悬液。细胞计数后每组取等数量的细胞，用PBS重悬细胞沉淀，按200μL／孔加样于96孔黑色检测板中；荧光酶标仪（激发波长500nm、发射波长525nm）下检测各组荧光强度。

1.2.6 黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活性 细胞按1.2.3实验组别进行分组干预，细胞刮刀刮下各组细胞，PBS清洗后4℃离心（2 000g，10min）分别收集细胞沉淀；收集细胞沉淀以超声破碎，向各孔加入反应物，37℃孵育20min，酶标仪（450nm处）检测OD值。SOD抑制率及活性的计算公式如下：

1.3 统计学处理 结果以±s表示，采用SPSS 11.5软件处理数据。多组间比较采用单因素方差分析（One－way ANOVA）或秩和检验，以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 HUVECs培养及鉴定 原代内皮细胞培养3h后开始贴壁，24h完全贴壁，早期贴壁细胞呈短梭形，细胞多成团生长，少数细胞分散生长；5～7d细胞单层铺满呈铺路石样生长（图1A）。内皮细胞FⅧ抗原相关染色鉴定，FⅧ是由因子FⅧ促凝成分（FⅧ∶C）和内皮细胞合成的vWF（von Willebrand factor）组成的一种复合物，内皮细胞鉴定即是通过观察FⅧ因子免疫组织化学染色完成，FⅧ抗原阳性细胞表现为胞浆中可见染成棕褐色的颗粒，即为HUVECs（图1B）。

图1 原代HUVECs培养及鉴定Fig 1 Culture and identification of HUVECs

2.2 GLP－1可降低高糖环境对HUVECs的毒性作用 以各处理组细胞上清中LDH漏出量与对照组细胞上清中LDH漏出量的百分比值评价细胞毒作用，结果表明30mmol／L葡萄糖作用7d对细胞有明显的毒性作用（图2），高糖组LDH漏出量为对照组的（181.07±3.35）%，GLP－1预处理组 LDH漏出量为对照组的（134.94±1.78）%（vs对照组，P＜0.01），比高糖组降低了46.13%（vs高糖组P＜0.01）。

2.3 GLP－1可降低高糖诱导 HUVECs产生的ROS水平 与对照组比较，单独高糖处理4d即可使HUVECs细胞内ROS产生增多近60%[（224.85±4.73）vs（141.80±3.79），P＜0.01]；7d则可使细胞内ROS增加1倍以上[（300.00±4.73）vs（137.58±7.37），P＜0.01]。选取高糖作用7d诱导内皮细胞损伤模型，同时行GLP－1预处理联合高糖共同作用，观察GLP－1对高糖下内皮细胞的保护作用。GLP－1预处理组细胞内ROS水平强度比单独高糖处理组降低了46.18%[（156.68±9.40）vs（291.14±12.21），P＜0.01]（图3）。

图2 胰高糖素样肽－1可降低高糖环境对人脐静脉内皮细胞的毒性Fig 2 GLP－1could reduce toxicity of high glucose in HUVECs

图3 胰高糖素样肽－1可降低高糖诱导人脐静脉内皮细胞产生的细胞内活性氧自由基水平Fig 3 GLP－1could decrease high glucoseinduced ROS in HUVECs

2.4 GLP－1可提高高糖环境下HUVECs细胞内SOD活力 与对照组比较，单独高糖处理7d组细胞内 SOD 酶活性无明显改变 [（23.81±1.41）vs（22.48±2.19）U／mgprot，P＞0.05]；GLP－1 预处理组SOD酶活性比单独高糖处理组升高了64.64%[（22.48±2.19）vs（39.20±2.21）U／mgprot，P＜0.01]（图4）。

图4 胰高糖素样肽－1提高高糖环境下人脐静脉内皮细胞细胞内超氧化物歧化酶活力Fig 4 GLP－1could increase the activity of SOD in HUVECs in high glucose

3 讨 论

在针对糖尿病心血管病变分子机制的研究中发现，高糖诱导内皮细胞功能紊乱是通过氧化应激实现的[6]。高糖通过非酶糖基化形成糖基化终末产物（advanced glycationend products AGES）、激活多元醇途径等生成大量ROS[7]。机体的抗氧化防御机制包括两大系统：清除各种活性氧和自由基的酶性抗氧化系统和非酶性抗氧化剂。酶性抗氧化系统主要包括SOD、GSH－PX和过氧化氢酶等。SOD是金属酶，能催化超氧阴离子的歧化反应，是抗氧化防御的第一线。过多的ROS超过机体抗氧化能力时消耗NO，导致血管舒张功能障碍，同时发挥细胞毒性损伤作用，诱导内皮细胞凋亡，破坏内膜完整性从而促发动脉粥样硬化进程。

GLP－1及其类似物作为一类新的降糖药物已成功地应用于2型糖尿病的治疗。它通过葡萄糖依赖性地作用于胰岛β细胞促进胰岛素的合成和分泌；抑制餐后胃排空、抑制食欲及促进肝脏、肌肉、脂肪组织糖原合成增多等机制来降低血糖。在针对其临床应用的荟萃分析中提示GLP－1还具有独立于上述作用之外的潜在的心血管保护作用[8]：可以改善内皮功能、促进心肌葡萄糖摄取、增加左室心功能和射血分数等。Nystrom等观察到GLP－1可以增加内皮依赖的血管舒张程度，提示其具有内皮细胞保护作用[9]。Younce等认为GLP－1发挥抗凋亡的作用与其抑制其内质网应激有关[10]。但尚缺乏足够的基础研究方面的依据。

本实验通过检测ROS、SOD活力等指标阐明细胞氧化应激状态与抗氧化能力。文献报道，利用高糖或其生成的AGES均可诱导内皮细胞ROS的升高，导致其功能障碍[11－12]。本研究在观察高糖培养HUVECs过程中，培养液中LDH的含量升高了1.8倍，证实了高糖对内皮细胞的毒性作用。同时观察到高糖培养4d开始细胞内ROS明显升高，7d ROS成倍升高，而细胞内SOD活力与对照组比较，差别无统计学意义，证实高糖可使内皮细胞ROS不断积聚，最终超出抗氧化系统的清除能力，导致细胞氧化应激状态，发挥细胞毒性损伤作用，研究结果与以往的文献报道一致。而在本课题组的前期研究中也证实了氧化剂第三丁基过氧化氢（t－BHP）可以诱导内皮细胞氧化损伤，使细胞一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）蛋白表达增加，胞内 NO 水平增高[13]。

大量动物实验表明，通过添加抗氧化剂或过表达SOD或过氧化氢酶能够预防组织细胞的病变，间接证明了ROS在糖尿病并发症的发生中起着重要作用。Yao等认为AGES诱导细胞功能障碍的关键机制是高糖诱导的氧化应激[14]，长期的高糖刺激下调乙二醛酶－1活性及基因蛋白表达，在过表达SOD基因后，乙二醛酶－1活性及表达得到恢复，AGES减少。本实验中，与单独高糖组比较，GLP－1干预后培养液中LDH的含量降低了46.13%，提示GLP－1可以减轻高糖对内皮细胞的毒性作用，同时伴随着细胞内ROS降低，SOD活力升高。Ding等研究发现，GLP－1可以激活eNOS的活性，促进eNOS磷酸化，上调eNOS蛋白表达[15]。Shiraki等发现，GLP－1类似物利拉鲁肽可以抑制肿瘤坏死因子诱导的HUVECs的ROS产生[16]，同时可以增加SOD、过氧化氢酶、GSH－PX等抗氧化酶的合成。以上均提示GLP－1可能是通过上调细胞内氧化防御系统的活性，减轻氧化应激，提高内皮细胞抗凋亡能力，改善内皮细胞功能。但对于GLP－1改善内皮细胞功能的具体信号机制还需要进一步研究。

综上所述，GLP－1可以改善高糖对 HUVECs的细胞毒性作用，保护高糖诱导的血管内皮细胞功能障碍，机制可能是通过减轻细胞氧化应激来实现的。研究结果将为临床应用GLP－1及其类似物治疗2型糖尿病、改善患者的心血管功能和减少心血管并发症提供实验依据。

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