落叶松—杨栅锈菌无性繁殖后代反应型及接种研究

马娥姣，余仲东，胥生荣，杜婷

(1．西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100;2．中国林业科学院资源昆虫研究所，云南 昆明 650000)

落叶松—杨栅锈菌Melampsora larici-populina Kleb．是冬孢菌纲锈菌目真菌，具有转主寄生性，在落叶松上产生性孢子和锈孢子，在杨树上产生夏孢子和冬孢子。该菌广泛分布于杨树栽培区，是引起青杨派和黑杨派等杨树叶部病害的重要病原，严重危害幼苗和幼树的生长并造成材积损失和材质下降［1］。长期以来，我国学者对该菌的研究集中在生理小种划分、遗传分化、组织病理学、细胞学和病害流行学［2-5］。本研究探索了落叶松—杨栅锈菌无性系菌株夏孢子接种寄主的反应型以及夏孢子不同接种浓度对寄主叶片夏孢子堆数量的影响，为进一步研究落叶松—杨栅锈菌与杨树互作提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料鉴别寄主为美洲黑杨Populus deltiodes、健杨P．×euramericana cv．‘Robusta’、杂交杨P．deltiodes×P．trichocarpa、波兰15号杨P．×euramericana cv．‘Polska 15A’、川杨P．×szechuanica的1年生扦插苗及卜氏杨P．purdomii 2年生实生苗，均来自西北农林科技大学苗圃，在西北农林科技大学植保学院温室盆栽培养。

落叶松—杨栅锈菌混合菌系Hj于2011年8月采自吉林省长春市净月潭森林公园内青杨，当年接种于温室栽培的卜氏杨上进行扩繁，培育5～7 d后，随机选取4个成熟的、未被污染的夏孢子堆(命名为Hj1，Hj2，Hj3，Hj4)分别接种于卜氏杨做单孢子堆分离，并扩大繁殖至足量，收取夏孢子干燥后，置于真空安瓿瓶在低温4～7℃保存，于2013年5月分别扩繁4个单孢化菌株备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株寄主反应型测定 采取叶盘法测定寄主反应型，操作方法参考［6］。采摘叶龄在5～20 d的各个鉴别寄主叶片，用直径为16 mm的打孔器打取叶盘，叶盘背面向上放入培养皿中，将上述Hj1，Hj2，Hj3，Hj4菌株新鲜夏孢子分别接种在各寄主叶盘上，每个处理重复3次，以不接种夏孢子的叶盘作为对照。接种完成后用封口膜将培养皿封口，放入25℃温室中培养，L∶D=16∶8。接种后定期观察14 d并记载各处理的潜育期、反应型(潜育期重复统计3次，取平均值)，寄主反应型分级标准参照［7］。

1.2.2 夏孢子接种浓度对寄主产生夏孢子堆数量的影响 配制浓度为2%的琼脂溶液，融化后倒在灭菌载玻片上形成薄膜，待其冷却凝固后用直径16 mm(201 mm2)的打孔器打取琼脂盘，采用相同规格的打孔器打取各鉴别寄主叶盘［8］。称取Hj1菌株夏孢子1，0．5，0．25，0．1 mg分别加入2 mL无菌水中制成夏孢子悬浮液，混匀后将其接种于琼脂盘和寄主叶盘上，各处理重复3次。接种后的琼脂盘和叶盘放入事先加入滤纸和少量无菌水的培养皿中，封口膜封口后置于25℃温室培养，L∶D=16∶8。24 h后在光学显微镜(10×10倍)下观察琼脂盘上夏孢子的萌发个数，每个琼脂盘观察3个视野(2．54 mm2/视野)，取各视野夏孢子萌发数的平均值计算夏孢子接种浓度(个/琼脂盘)。寄主叶盘上夏孢子接种浓度即琼脂盘上夏孢子接种浓度，观察计算可知0．5，0．25，0．123，0．05 g/mL夏孢子悬浮液浓度对应夏孢子实际接种浓度分别为12 388，4 827，1 899，950个/叶盘。接种15 d后统一统计各寄主叶盘上产生夏孢子堆的数量(个)，同一寄主3次重复取平均值。

寄主叶盘夏孢子接种浓度=每个视野夏孢子萌发数÷2．54×201

2 结果与分析

2.1 菌株寄主反应型测定从各寄主对不同菌株的反应型可以看出，寄主的反应型可以分为免疫型和高度感病型2个类群(表1)。美洲黑杨对4个菌株均表现为免疫;健杨、杂交杨、波兰15号杨、川杨、卜氏杨对各菌株都表现为高感，反应型为3+～4，以上结果表明单孢化的4个菌株致病力一致，属于同一个生理小种。

表1 单孢化的各菌株在鉴别寄主上的反应型

与此同时，各菌株在不同鉴别寄主上的潜育期也表现出明显差异(表2)。美洲黑杨在接种14 d内未见其发病或者出现退绿、坏死等过敏性反应，对4个菌株表现为免疫型。健杨、杂交杨、波兰15号杨、川杨、卜氏杨的潜育期为4～6 d，符合高感品种发病规律，同上述反应型测定结果一致。

表2 单孢化的各菌株在鉴别寄主上的潜育期 d

2.2 夏孢子接种浓度对产生夏孢子堆数量的影响

由图1可知，夏孢子接种浓度对孢子堆数量的影响在不同寄主上表现有差异。在感病品种中，随着夏孢子接种浓度的增加，健杨、杂交杨、波兰15号杨、川杨和卜氏杨上产生夏孢子堆的数量也同时增加。当夏孢子接种浓度达到最大值12 388个/叶盘时，各个寄主上夏孢子数量达到最大值，健杨夏孢子堆数目为73个，杂交杨为97个，波兰15号杨为118个，川杨为161个，卜氏杨为123个。同一夏孢子接种浓度接种不同的杨树品种时，产生的夏孢子堆数量也不同。

图1 不同接种浓度对产生夏孢子堆数量的影响

美洲黑杨对该菌株免疫，当夏孢子接种浓度达到12 388个/叶盘时一直不感病。

3 结论与讨论

本研究结果证实，落叶松—杨栅锈菌混合菌系Hj无性繁殖后代Hj1，Hj2，Hj3，Hj4在各个常见鉴别寄主上具有相同的反应型和潜育期，表明4个无性系后代遗传多样性单一，属于同一个生理小种，同时也说明了无性繁殖并不是落叶松—杨栅锈菌发生遗传变异的主要原因，有性杂交才是导致该锈菌致病性和遗传多样性发生变异的主要因素。田呈明等［4］应用RAPD技术对落叶松—杨栅锈菌生理分化进行了研究，并和致病性结果进行了比较，发现该菌存在明显的生理分化现象，各菌株之间的差异在0～33．1%之间。曹支敏认为［9］，落叶松—杨栅锈菌致病性变异较为普遍，即使是在同一地域环境下，从不同年份、不同批次所采集的锈菌菌样中所获得的菌系之间致病性可出现变异。在转主寄主(落叶松)大量存在的秦岭林区天然林中，有性杂交是导致该锈菌致病性发生变异的主要原因。

接种研究结果表明落叶松—杨栅锈菌同一菌系夏孢子不同接种浓度对寄主上产生夏孢子堆数量有影响，同一接种浓度接种不同寄主后产生的孢子堆数量也有不同。对感病品种来说，随着夏孢子接种浓度的增加，感病寄主叶片单位面积产生的夏孢子堆数量增加，这一结论与Pei和Giorcelli［10-11］对落叶松—杨栅锈菌、柳树锈菌Melampsora larici-epitea的相关研究结果相同。在研究接种浓度的基础上，Pei通过相关性分析和建立模型认为叶片上夏孢子堆数目和面积有关;同时对整个叶盘上产生的夏孢子数目计数分析认为夏孢子产量和夏孢子堆面积相关。Giorcelli也认为，当接种浓度超过50 units/cm2时，孢子堆面积由1．5～1．6 mm2减少到0．8～0．9 mm2;当接种浓度超过100 units/cm2时，孢子堆面积减少至0．4～0．6 mm2。综上，接种浓度、夏孢子数量、夏孢子堆面积之间互相影响，共同作用锈菌对寄主的侵染。因此在接种浓度一定的情况下，可以通过夏孢子数量、夏孢子堆面积和产量来综合说明锈菌和寄主互作。例如，研究中可引入侵染效率(侵染效率是指一个叶盘上夏孢子堆数除以叶盘上产生的夏孢子个数)的概念来说明不同接种组合的侵染情况，Pei研究发现实验中的4个菌系的侵染效率为0．008～0．167，Giorelli研究证明E1小种的侵染效率为0．47，E3小种的侵染效率是0．64。Pei对柳树锈病研究发现不同接种组合的侵染效率也不同［12］。以上侵染效率等的研究是通过叶盘法来实现的，操作简单、方便，因此用叶盘法统计的侵染效率和植株反应型测定结合起来鉴定锈菌生理小种不失为一种可靠的方法。

落叶松—杨栅锈菌广泛分布于各种植区，对落叶松和杨树产生一定危害。随着该菌接种浓度增大，孢子堆数量增多，产生夏孢子数量变多，因此二次侵染基数变大，且感病品种潜育期短，很容易造成某一毒性小种在一地理区域快速扩散、集中暴发，造成危害，因此造林时避免单一林分，并提高杨树抗病性是目前预防落叶松—杨栅锈菌发生的重要措施。

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