糖尿病肾病患者肾脏组织中C3aR、C5aR的表达*

张朝甲，张 颖，刘 璐，杜 路，周雅丽，权松霞，邢国兰

1)郑州大学第一附属医院肾脏内科 郑州450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州450052 3)郑州大学肾脏病研究所郑州450052

#通讯作者，女，1964年8月生，博士，教授，研究方向:慢性肾功能衰竭的防治，E-mail:xgl@zzu.edu.cn

随着社会的发展、人类的生活方式和饮食结构的改变，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者数量呈逐年上升趋势。流行病学调查［1］显示目前我国20岁以上的成人DM 患病率为9.7%(男性10.6%，女性8.8%)。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是DM 的一种重要微血管并发症，它不仅加重了DM 患者的经济负担，而且造成病死率增加，严重影响人类的健康和社会经济的发展。DN 的发生发展机制目前尚不清楚。以往对DN 发病机制的研究主要集中在高血糖所致的多元醇通路激活、蛋白质非酶糖化、氧化应激、脂代谢紊乱等方面［2］，治疗主要集中在控制血糖、血压、应用糖基化阻断剂、低蛋白饮食、调整血脂代谢方面，然而从以上几方面着手并不能十分有效地干预DN 的发生发展，这提示尚有其他机制参与DN 的发病。有文献［3］报道，补体通过旁路途径、甘露聚糖结合凝集素途径活化后参与DN 的发病过程。补体活化过程中产生过敏毒素C3a、C5a，是补体致炎的主要分子，而C3a、C5a 通过与相应受体C3aR、C5aR 结合发挥作用。目前C3a、C5a 与DN 关系的国内外报道均十分有限。作者检测了不同病理损伤级别DN 患者肾脏组织中C3aR、C5aR 的表达情况，探讨C3aR、C5aR 与DN 的关系，报道如下。

1 对象与方法

1.1 病例选择和血液相关指标检测 选取2012年1月至2013年5月在郑州大学第一附属医院肾脏内科住院行肾穿刺活检术并经临床和病理诊断为DN 患者的石蜡标本共45例，按照病理分级标准［4］分为Ⅰ+Ⅱ级(13例)、Ⅲ级(21例)、Ⅳ级(11例)。选取10例同期在泌尿外科住院行肾脏肿瘤切除术患者远离肿瘤的肾脏组织石蜡标本作为正常对照，均经病理学证实无病变。DN 患者均在入院后第2天清晨空腹抽取肘静脉血，常规方法进行血液相关指标检测。

1.2 肾脏组织中C3aR、C5aR 表达的免疫组化检测 石蜡标本按3 μm 厚度连续切片。染色步骤按免疫组化PV 二步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)说明书进行。兔抗人C3aR 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，美国)按1∶100 稀释，小鼠抗人C5aR 单克隆抗体(Abd Serotec 公司，英国)按1∶1 000稀释，DAB 显色，中性树胶封片，晾干后在显微镜下观察计数。用PBS 代替一抗作为阴性对照。C3aR、C5aR 均以细胞核或细胞质呈现棕黄色颗粒或者黄色颗粒为染色阳性细胞。每张切片选取10 个不重叠视野，高倍镜下计数200 个细胞，计算阳性细胞百分比［5］。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行分析。所有计量资料均进行正态分布和方差齐性检验;应用单因素方差分析和LSD-t 检验、χ2检验或Kruskal-Wallis 检验比较DN 患者临床资料的差异;应用Spearman 相关性分析评判DN 患者肾脏病理损伤级别、肾组织中C3aR 和C5aR 的表达情况与临床指标的相关性。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组DN 患者临床资料的比较 见表1。

表1 DN 患者临床资料

2.2 DN 患者肾脏病理损伤级别与部分临床指标的相关性分析 DN 病理损伤级别与24 h 尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮、C-反应蛋白呈正相关，而与血清C3、红细胞沉降率、平均动脉压无相关性(表2)。

表2 DN 患者肾脏病理损伤级别与部分临床指标相关性分析

2.3 各组肾脏组织中C3aR、C5aR 的表达 正常肾脏组织中可见少量肾小管上皮细胞表达C3aR 和C5aR，肾小球及肾间质未见。DN 患者肾脏组织中C3aR 和C5aR 于肾小管上皮细胞表面表达尤为显著，在肾小球系膜细胞、包曼囊壁层上皮细胞及间质浸润的炎性细胞表面也有不同程度的表达(图1)，并且随着肾脏病理损伤级别的增加C3aR 和C5aR的表达逐渐增强(表3)。

2.4 DN 患者肾脏组织中C3aR、C5aR 阳性表达与临床指标的相关性分析 各组DN 患者肾脏组织中C3aR、C5aR 阳性细胞百分比均与24 h 尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮、红细胞沉降率、C-反应蛋白呈正相关，而与血清C3、平均动脉压无相关性(表4)。

图1 各组肾脏组织中C3aR、C5aR 的表达(PV，×200)

表3 各组肾脏组织中C3aR、C5aR 阳性细胞百分比比较 %

表4 DN 患者肾脏组织中C3aR、C5aR 阳性细胞百分比与临床指标的相关性分析

3 讨论

C3a、C5a 是补体激活后所产生的最主要的致炎症补体裂解产物，其诱发的炎症反应是由特异的受体C3aR、C5aR 介导的。段喜梅等［6］应用免疫组化及ELISA 方法研究发现C3a、C5a 在IgA 肾病病理损伤过程中起重要作用。有学者［7］发现C3a、C5a可促进肾脏缺血再灌注损伤，C5aR 拮抗剂能够降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症介质的表达、降低趋化因子表达水平并减少单核细胞的浸润。

C3a、C5a 与其相应受体C3aR、C5aR 可产生扩张血管、增加血管通透性、趋化炎症细胞、引起炎症反应等效应［8］。该研究发现DN 患者的肾脏组织的确存在不同程度的炎性细胞浸润，而持续的炎性细胞浸润又与肾间质纤维化、肾脏病理损伤加重等关系密切，考虑这一现象可能与C3aR、C5aR 表达增多、趋化炎症细胞效应增强有关，但需相关实验进一步证实。同时该研究在不同病理损伤级别DN 患者的肾脏组织中均检测出C3aR、C5aR 表达;与正常对照组肾脏组织相比，除在肾小管上皮细胞胞膜均有C3aR、C5aR 表达外，DN 患者的肾小管基底膜、包曼囊壁层上皮细胞及肾间质浸润的炎症细胞亦有C3aR、C5aR 表达，且随DN 患者肾脏病理损伤程度的加重而表达逐渐增强。以上研究提示C3a、C5a与C3aR、C5aR 结合后，参与DN 患者肾小球、肾小管以及肾小管间质病变的损伤过程。

DN 患者肾脏病理损伤级别及C3aR、C5aR 在肾脏组织中的表达情况均与评估肾脏状况的临床指标(如:24 h 尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮)呈正相关。同时结合该研究的免疫组化及相关数据分析可知，DN 患者肾脏病理损伤程度较重者，其肾脏组织C3aR、C5aR 表达较强。由此可见C3aR 和C5aR 在DN 患者肾脏组织的表达增强，对DN 患者肾脏组织造成不同程度的损伤，可能参与DN 的进展。

综上所述，C3aR、C5aR 在DN 患者肾脏病理损伤过程中起促进作用，可影响疾病的进展。该研究结果为寻找DN 治疗的新靶点提供了理论依据。

［1］Yang WY，Lu JM，Weng JP，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China［J］.N Engl J Med，2010，362(12):1090

［2］杨维娜，王璇，蓝茜，等.2 型糖尿病并发周围血管病变的临床流行病学分析［J］.西安交通大学学报:医学版，2013，34(1):73

［3］Fan WX，Huang SM，Liu F，et al.Activation of the lectin complement pathway on human renal glomerular endothelial cells triggered by high glucose and mannose-binding lectin［J］.African J Biotechnol，2011，80(10):18539

［4］Tervaert TW，Mooyaart AL，Amann K，et al.Pathologic classification of diabetic nephropathy［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21(4):556

［5］Li Q，Peng Q，Xing G，et al.Deficiency of C5aR prolongs renal allograft survival［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21(8):1344

［6］段喜梅，张颖，刘璐，等.C3a，C5a 及其受体在IgA 肾病发病中的作用［J］.郑州大学学报:医学版，2012，48(3):313

［7］Peng Q，Li K，Smyth LA，et al.C3a and C5a promate renal ischemia-reperfusion injury［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23(9):1474

［8］曹雪涛.医学免疫学［M］.6 版.北京:人民卫生出版社，2013:57