双歧杆菌、酪酸梭菌及谷氨酰胺对慢性应激模型小鼠肠黏膜屏障的影响*

王玉玉，张 军 ，郑鹏远 ，李付广，刘志强，陈东晖

1)郑州大学第二附属医院消化内科 郑州450014 2)郑州大学第二附属医院药剂科 郑州450014 3)郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室 郑州450001 4)深圳市耳鼻咽喉研究所 深圳518000

#通讯作者，张军，女，1955年1月生，副教授，副主任药师，研究方向:安全用药、合理用药，E－mail:zdefyzj@163.com;郑鹏远，男，1965年2月生，博士，教授，主任医师，研究方向:胃肠道感染与免疫，E－mail:medp7123@126.com

应激是机体对外界刺激的非特异性适应性反应，长期处于应激状态会引发机体的各种应激性疾病，如肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)。目前认为IBS 的发病是多因素的，涉及胃肠动力异常、内脏敏感性异常和心理因素等。肠黏膜屏障的完整性缺失与IBS 黏膜免疫活化和肠道功能失调有关［1］。IBS 亚群患者肠通透性存在异常，且与内脏高敏和排便习惯有关［2－3］。研究［4］表明IBS 患者黏膜屏障的结构、功能异常与临床症状有关，提示肠黏膜屏障在IBS 发病中发挥重要作用。双歧杆菌可缓解应激大鼠肠道细菌移位、肠道通透性改变等现象;酪酸梭菌分泌的酪酸是结肠细胞优先利用的能源物质;谷氨酰胺广泛应用于临床营养，已证明可以改善多种疾病状态的肠黏膜屏障，降低肠道通透性［5－6］。作者采用避水实验诱导小鼠慢性应激模型，应用双歧杆菌、酪酸梭菌和谷氨酰胺进行治疗，评价其对小鼠肠道通透性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料 SPF 级Balb/c 小鼠60 只，雄性，6～8 周龄，体重(20±2)g，购自郑州大学实验动物中心，小鼠自由摄取标准饮食和水，适应环境1周，温度20～26℃，湿度(50±10)%。双歧杆菌、酪酸梭菌菌粉由山东科兴生物制品有限公司惠赠，谷氨酰胺购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 双歧杆菌、酪酸梭菌悬液及谷氨酰胺药液的配制 双歧杆菌、酪酸梭菌菌粉用无菌生理盐水配成1×107CFU/mL 悬液。谷氨酰胺用无菌生理盐水溶解，按人与小鼠之间的用药剂量换算，配制成质量浓度为40 g/L 的药液备用。

1.3 实验动物分组及应激模型的建立 应用随机数字表法将60 只小鼠分为6组:正常对照组、模型对照组、双歧杆菌干预组、酪酸梭菌干预组、谷氨酰胺干预组、联合干预组。正常对照组和模型对照组分别用生理盐水0.5 mL 灌胃，双歧杆菌干预组用0.5 mL 双歧杆菌1×107CFU/mL 灌胃，酪酸梭菌干预组用0.5 mL 酪酸梭菌1×107CFU/mL 灌胃，谷氨酰胺干预组用0.5 mL 40 g/L 谷氨酰胺灌胃，联合干预组各用0.5 mL双歧杆菌1×107CFU/mL+ 0.5 mL 40 g/L 谷氨酰胺灌胃。每日9:00 给药一次，各干预组均从造模开始前4 d 开始连续给药，直至造模结束。根据既往方法建立避水实验模型［7］:每日称质量给药后，除正常对照组外其余各组动物均放置到10 cm×10 cm的平台上，平台固定在直径为100 cm、深25 cm 的有水塑料容器内，离水面的距离为2 cm。每天放置2 h(上午9:00～11:00)，连续10 d。

1.4 小鼠肠道通透性测定 血清D－乳酸和二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)含量可反映肠黏膜的通透性。造模结束后用眼眶静脉丛采血法取血，用ELISA 法测定各组小鼠血清D－乳酸和DAO 的含量。ELISA 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

1.5 肠道闭锁小带(zonula occluden-1，ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)mRNA 表达的RT-PCR 检测在GenBank 中查找目的基因序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成相关引物(表1)。Trizol 法提取小肠、结肠组织总RNA 进行RTPCR。PCR 反应体系:cDNA 模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，总体积25 μL。PCR 反应条件:94℃预变性5 min;94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，共30 个循环;72℃延伸5 min，4℃保存。取扩增产物行20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，采用溴化乙锭染色，用凝胶成像分析仪分析条带的灰度值，以目的基因与内参β－actin 条带平均灰度值的比值表示目的基因的表达水平。

表1 引物的序列及产物大小

1.6 肠道ZO-1、Occludin 蛋白表达的Western blot 检测 取小肠、结肠组织100 mg，加入蛋白裂解液制备蛋白样品。SDS－PAGE 凝胶电泳1 h，转膜。室温封闭1 h。一抗(鼠抗ZO－1、Occludin 多克隆抗体，购自北京奥博森生物技术有限公司)均按1∶300稀释，4℃孵育1 h。二抗4℃孵育1 h，显色。用成像扫描分析系统分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参β－actin 条带平均灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行分析，应用单因素方差分析和LSD－t 检验比较各组小鼠血清D－乳酸、DAO 含量和ZO－1、Occludin mRNA 及蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠肠道通透性测定 见表2。与正常对照组相比，模型对照组、各干预组血清D－乳酸、DAO 含量显著升高;与模型对照组相比，正常对照组、各干预组血清D－乳酸、DAO 含量显著下降。

表2 各组小鼠血清D-乳酸、DAO 检测结果(n=10)μg/L

2.2 各组小鼠肠道ZO-1、Occludin mRNA 及蛋白表达的比较 见表3、4，图1、2。

表3 各组小鼠小肠ZO-1、Occludin 的表达(n=10)

表4 各组小鼠结肠ZO-1、Occludin 的表达(n=10)

图1 各组小鼠肠道ZO-1、Occludin mRNA 的表达

图2 各组小鼠肠道ZO-1、Occludin 蛋白的表达

结果显示模型对照组、各干预组小肠、结肠的ZO－1、Occludin mRNA 和蛋白表达量较正常对照组显著降低;各干预组小肠、结肠ZO－1、Occludin mRNA 和蛋白表达较模型对照组均显著升高。

3 讨论

肠黏膜屏障形成分隔肠腔与内环境的物理屏障，肠上皮屏障结构和功能完整性的缺失利于食物和细菌抗原的自由渗透，刺激破坏性的免疫反应和黏膜炎症的发展，参与多种疾病的发病，如IBS。肠道机械屏障中的紧密连接是决定肠道通透性的重要因素，紧密连接蛋白数量和分布的改变直接影响肠道通透性。ZO 和Occludin 是重要的紧密连接蛋白。IBS 患者的肠黏膜屏障功能失调与结肠黏膜中ZO－1下调和蛋白酶介导的Occludin 降解有关。Occludin在腹泻型－IBS 患者空肠肠上皮细胞的细胞质中显著增加，提示Occludin 大量内化，而健康人Occludin 主要位于紧密连接处［8］。该实验中也发现，应激小鼠小肠、结肠上皮ZO－1、Occludin 表达有不同程度减少。

益生菌可以抑制肠道通透性增高和内脏高敏性，从而改变肠道对应激的黏膜反应［9］，降低压力诱导的结肠通透性增高［10］。该实验中益生菌干预后，应激小鼠症状显著改善，紧密连接蛋白ZO－1、Occludin 表达升高，肠道通透性也相应降低。有研究［11］表明，双歧杆菌可以降低坏死性肠炎小鼠升高的肠道通透性，维持密封蛋白－4 和ZO 在紧密连接中的结构、位置。人体摄入多种益生菌后，可显著减少粪便中连接蛋白的含量，提示肠道通透性降低。益生菌改变肠道通透性的机制之一可能是通过影响促肾上腺皮质激素释放因子水平实现的［12］。有研究［13］报道，对急性应激大鼠应用益生菌干预2 周后，大鼠血浆促肾上腺皮质激素、皮质醇含量以及下丘脑脂多糖表达降低，结肠细胞间高通透性和门脉血中脂多糖水平的升高也有所缓解，但其具体的作用机制仍需更深入的研究。

谷氨酰胺是血液和体内游离氨基酸池中最丰富的氨基酸，它是小肠黏膜细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞及恶性细胞等快速分裂细胞的重要能源物质。谷氨酰胺可能是维持肠道代谢、结构、功能基本的成分，特别是在肠黏膜屏障受损的情况下。谷氨酰胺缺陷可能会导致细胞膜通透性增加，补充谷氨酰胺则可以恢复肠道通透性。谷氨酰胺在临床营养中应用广泛，可以改善外科手术后、烧伤、放疗、化疗及胰腺炎等患者的肠黏膜，降低肠道通透性，从而减少肠道菌群易位，抑制促炎性细胞因子的产生［］。研究［15］发现肠道通透性增高的IBS 亚群患者出现谷氨酰胺合成水平下降。该实验结果表明谷氨酰胺可明显降低应激模型小鼠的肠道通透性及紧密连接蛋白的表达。

IBS 的临床表现和发病机制均有异质性。虽然关于IBS 发病机制的研究进展迅速，但目前仍缺乏有效的治疗手段。该研究结果显示，双歧杆菌联合谷氨酰胺能较好恢复肠道紧密连接蛋白水平，降低肠道渗透性，恢复肠黏膜屏障功能。该研究可望为IBS 的治疗提供新的理论依据。

［1］Coëffier M，Gloro R，Boukhettala N，et al.Increased proteasome－mediated degradation of occludin in irritable bowel syndrome［J］.Am J Gastroenterol，2010，105(5):1181

［2］Zhou QQ，Zhang BY，Verne GN.Intestinal membrane permeability and hypersensitivity in the irritable bowel syndrome［J］.Pain，2009，146(1/2):41

［3］Piche T，Barbara G，Aubert P，et al.Impaired intestinal barrier integrity in the colon of patients with irritable bowel syndrome patients:involvement of soluble mediators［J］.Gut，2009，58(2):196

［4］Martínez C，Gonzalez－Castro A，Vicario M，et al.molecular basis of intestinal barrier dysfunction in the irritable bowel syndrome［J］.Gut Liver，2012，6(3):305

［5］全竹富，袁志超，黎介寿.丙氨酰－谷氨酰胺双肽对腹部术后病人肠道通透性和应激反应的影响［J］.肠外与肠内营养，2008，15(6):343

［6］李幼生，黎介寿，于泽平，等.谷氨酰胺预防新辅助化疗导致肠道损伤的前瞻性、随机研究［J］.肠外与肠内营养，2003，10(1):24

［7］Zareie M，Johnson－Henry K，Jury J，et al.Probiotics prevent bacterial translocation and improve intestinal barrier function in rats following chronic psychological stress［J］.Gut，2006，55(11):1553

［8］Martínez C，Lobo B，Pigrau M，et al.Diarrhoea－predominant irritable bowel syndrome:an organic disorder with structural abnormalities in the jejunal epithelial barrier［J］.Gut，2013，62(8):1160

［9］Ait－Belgnaoui A，Han W，Lamine F，et al.Lactobacillus farciminis treatment suppresses stress induced visceral hypersensitivity:a possible action through interaction with epithelial cell cytoskeleton contraction［J］.Gut，2006，55(8):1090

［10］Eutamene H，Lamine F，Chabo C，et al.Synergy between Lactobacillus paracasei and its bacterial products to counteract stress－induced gut permeability and sensitivity increase in rats［J］.J Nutr，2007，137(8):1901

［11］Bergmann KR，Liu SX，Tian R，et al.Bifidobacteria stabilize claudins at tight junctions and prevent intestinal barrier dysfunction in mouse necrotizing enterocolitis［J］.Am J Pathol，2013，182(5):1595

［12］Zheng PY，Feng BS，Oluwole C，et al.Psychological stress induced eosinophils to produce corticotrophin releasing hormone in the intestine［J］.Gut，2009，58(11):1473

［13］Ait－Belgnaoui A，Durand H，Cartier C，et al.Prevention of gut leakiness by a probiotic treatment leads to attenuated HPA response to an acute psychological stress in rats［J］.Psychoneuroendocrinology，2012，37(11):1885

［14］Mbodji K，Torre S，Haas V，et al.Alanyl－glutamine restores maternal deprivation－induced TLR4 levels in a rat neonatal model［J］.Clin Nutr，2011，30(5):672

［15］Zhou Q，Souba WW，Croce CM，et al.MicroRNA－29a regulates intestinal membrane permeability in patients with irritable bowel syndrome［J］.Gut，2010，59(6):775