绿豆芽中SOD的分离纯化、固定化及性质研究

梁丽琴，程琳，李继变，段江燕

（山西师范大学生命科学学院，山西临汾041004）

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC1.15.1.1简称SOD）能够催化超氧化物自由基歧化为O2与H2O，从而防止因超氧自由基在生物体内的过多积累而引起疾病或衰老，是一种具有重要生物医学意义的金属酶。据其活性部位结合金属离子的不同，目前生物体中已发现的SOD主要有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD及Ni-SOD4种。

由于动物血液具有疾病多，价格昂贵等缺点，因而以成本低廉，SOD含量丰富且无污染的植物为材料提取SOD势在必行；水稻、玉米、沙棘、大豆中的SOD提取纯化目前已有较全面的研究[1]，而绿豆芽中的SOD提取纯化研究则较少；此外，天然SOD稳定性差，易失活，不能重复利用，而固定化酶则可克服以上缺点，为此，以绿豆芽为材料提取纯化SOD，并对其加以固定化，从而为将SOD更好的应用于食品及医药工业奠定理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

绿豆种子（中绿一号）、牛血清白蛋白、邻苯三酚、硫酸铵（（NH4）2SO4）、丙烯酰胺（Acr）、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）、四甲基乙二胺（TEMED）、乙二胺四乙酸（EDTA）、过硫酸铵（AP）、二乙胺基乙基纤维素、考马斯亮蓝（G250）等为分析纯。

1.2 主要仪器

TGL-16G-A型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；UV-7504型紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；HD-2001-B-C型核酸蛋白检测仪：上海嘉鹏科技有限公司；层析实验冷柜：北京博医康实验仪器有限公司；DYY-2C型电泳仪及DYCZ-24D型双垂直电泳槽：北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 SOD粗酶液的制备

绿豆用沸水冲洗3次，25℃恒温箱培养7 d，取去根尖的绿豆胚20 g研磨成匀浆，加30 mL 0.05 moL/L磷酸缓冲液混匀，用四层纱布过滤。滤液经高速冷冻离心机离心15min（4000r/min，4℃），上清液即粗提酶液。

1.3.2 SOD酶液的纯化

向粗提酶液中加硫酸铵至30%、35%、40%、45%饱和度，混匀，4℃静置过夜，离心15min（4℃，4000 r/min），取上清液，继续加硫酸铵至80%饱和度，静置6 h后离心 15 min（4℃，4000 r/min），沉淀用 5 mL 0.025 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液溶解。溶解液加入1.25 mL95%冷乙醇和0.75 mL冷氯仿，边加边搅拌，10000 r/min离心10 min，取上清液对蒸馏水透析过夜。透析液用聚乙二醇浓缩至一定体积。浓缩液用DEAE-纤维素-32上柱（2 cm×40 cm），用0.025 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液洗脱，流速为1.5 mL/管/4 min。以上各步均需测蛋白质的含量和酶的活力。

1.3.3 蛋白质含量的测定

考马斯亮蓝结合法[2]，标准曲线回归方程：A595nm=0. 0825+0. 0083×蛋白质含量

1.3.4 SOD纯度的鉴定—PAGE电泳[2]

1.3.5 绿豆芽SOD的鉴定[3]

1.3.5.1 H2O2对绿豆芽SOD活力抑制

取4只洁净试管，各加入 15%H2O215、20、25、30μL及适量层析SOD酶液，于30℃水浴恒温30 min，取出迅速冷却至25℃，测定酶活力，并计算其相对活力。

1.3.5.2 KCN对绿豆芽SOD活力抑制

取6只洁净试管，各加入10 mmol/L KCN 100、200、300、400、500、600μL及适量绿豆芽SOD酶液。于30℃水浴恒温30 min，取出迅速冷却至25℃，测定酶活力，并计算其相对活力。

1.3.6 绿豆芽SOD固定化酶制备[4]

取5支洁净的小烧杯，按表1加样并混匀，于4℃冰箱中静置24 h后即得固定化酶胶体。

1.3.7 绿豆芽SOD活力的测定

1.3.7.1 自由酶活力的测定

邻苯三酚法[5]（前3 min与时间呈线性关系，经计算得邻苯三酚自氧化速率为0.070 nm/min。）

表1 固定化酶制备加样表Table 1 The formula on preparation of immobilized superoxide dismutase

1.3.7.2 固定化酶活力的测定

取6支离心管，分别加入pH8. 20.1 mol/LTris-HCl缓冲液 4.5 mL，1 号试管加入蒸馏水 4.2 mL。2、3、4、5、6号试管加入蒸馏水4.1 mL，再分别加入用0.1 mL的游离酶液配制成固定化酶粉末，凝胶浓度分别为17.5%、20.0%、22.5%、25.0%、27.5%，混匀后于25℃预热20 min。然后分别加入25℃预热过的邻苯三酚0.3 mL（在1号管用0.3 mL 10 mmol/L盐酸代替），开始计时，同时震荡离心管，准确反应4 min后，立即分别加入1滴8 mol/LHCl终止反应。将6支离心管置离心机中，8000 r/min离心10 min，取上清夜，以1号管为空白管，在420 nm波长处测定其吸光值。

1.3.7.3 洗涤酶活力的测定

将凝胶浓度分别为17.5%、20.0%、22.5%、25.0%、27.5%的固定化酶取出，碎成1 mm见方的小颗粒，装入层析柱，用少量双蒸水洗涤3～4次，合并洗涤液，进行酶活力测定，方法同1.3.7.1。

1.3.7.4 固定化结果分析

2 结果与分析

2.1 不同pH磷酸缓冲液对绿豆芽SOD提取结果的影响

不同pH磷酸缓冲液对绿豆芽SOD提取结果的影响见图1。

图1 不同pH缓冲液中的SOD活力Fig.1 Activity of SOD in different pH

图1表明，磷酸缓冲液的pH在7.7～8.0范围内，pH7.8时提取液中SOD的活力最高，当缓冲液中含有0.1 mmol/L EDTA时，溶液中SOD的活力则大幅度升高。因而取0.05 mol/L pH7.8（内含0.1 mmol/L EDTA）的磷酸缓冲液来提取绿豆芽SOD。

2.2 不同硫酸铵浓度对绿豆芽SOD纯化结果的影响

不同硫酸铵浓度对绿豆芽SOD纯化结果的影响见图2。

由图2可以看出，用不同浓度的硫酸铵处理绿豆芽上清液，随着硫酸铵浓度的增大，沉淀去除的蛋白质越多，但酶的活力回收也越低，从去杂蛋白和活力回收这两方面考虑，以40%饱和度硫酸铵最佳，这样既可以去除更多的杂蛋白又保留较多的酶。

2.1 DEAE-纤维素-柱层析

DEAE-纤维素-柱层析见图3。

图3 DEAE-纤维素-柱层析Fig.3 DEAE-cellulose-column chromatography

由图3可以看出，吸光值曲线有一个高峰和一个小峰，结合抑制率曲线分析可知小峰为杂蛋白。在吸光值曲线高峰管附近选择酶活力较高的管进行电泳和酶的固定化。

2.4 绿豆芽SOD纯化结果

绿豆芽SOD纯化结果见表2。

表2 绿豆芽SOD纯化结果Table 2 The purified of mung bean sprouts SOD purified

由表2可以看出，粗提液经盐析和层析之后，酶的比活达到4.662×10-5kat/mg，总酶活回收率为43.7%，纯化倍数为26.4。

2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定绿豆芽SOD蛋白质纯度

聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定绿豆芽SOD蛋白质纯度见图4、图5。

图4 电泳图Fig.4 The electrophoretograms

图5 层析酶的电泳分析图Fig.5 The electrophoretic analysis chart of purified enzyme

由图4可以看出，未层析酶的电泳图中有3条带，层析酶酶的电泳图中有2条带。从有关资料查证纯化SOD酶的电泳图中有2条带，因而说明层析酶为纯化的SOD。由图5可知，层析酶的电泳图中有2个迁移率峰，再次说明层析酶已为纯化的SOD。

2.6 H2O2和KCN对绿豆芽SOD活力的抑制

H2O2和KCN对绿豆芽SOD活力的抑制见图6。

图6 H2O2和KCN对绿豆芽SOD活力的抑制Fig.6 The results of H2O2and KCN in hibiting the activity of mung bean sprouts SOD

由图6可以看出，采用1.5%H2O2和10 mmol/L KCN作用于绿豆芽SOD30 min（30℃），随着二者体积的加大，H2O2和KCN对SOD活力的抑制也逐渐增加，当二者体积分别增大至30 μL及600 μL时，绿豆芽SOD的相对酶活力分别降低至15%及7%，这说明H2O2和KCN对SOD活力的抑制很显著。而据资料[7]显示，Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不敏感，Cu，Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感，Fe-SOD对氰化物不敏感，这表明，绿豆芽SOD为Cu，Zn-SOD。

2.7 聚丙烯酰胺凝胶固定化SOD

聚丙烯酰胺凝胶固定化SOD见图7。

图7 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶固定化SOD活力Fig.7 The activety of SOD immobilized with different concentration of polyacrylamide gelatin

由图7可以看出，0.1 mL的绿豆芽SOD游离酶经固定化后活性下降。其中22.5%的聚丙烯酰胺凝胶作包埋剂时活性较高。这是由于低浓度的聚丙烯酰胺固定化凝胶较稀，网孔较大，经水洗时，可能损失较多，故活性丧失较大。而高浓度的聚丙烯酰胺固定化凝胶较硬，不利于催化底物发生反应，则固定化酶的活性比较小。

采用22.5%的聚丙烯酰胺凝胶固定绿豆芽SOD，对固定化酶及游离酶的活力进行比较，结果如表3所示。

从表3可以看出，固定化酶的结合效率达87.0%，其活力回收率为80.9%。固定化酶的酶活力小于游离酶，其原因可能是酶分子在固定化的处理过程中，空间构象会发生变化。酶固定化后，其分子的空间自由度受到限制，影响酶分子活性中心对底物的定位作用。对于大分子底物如蛋白质等生物大分子，酶反应的空间效应表现的更为明显。同时因为载体的空隙太小，或者是固定方式与位置不当，给酶的活性部位造成空间屏障。这种空间屏障使酶分子的活性基团不易与底物或效应物接触，其直接结果是影响固定化酶的活力。

表3 固定化结果Table 3 The results on immobilizing superoxide dismutase

3 结论

1）用pH7.8磷酸缓冲液（内含EDTA）提取SOD效果较好，可达3.571×10-7kat/20 g绿豆芽。

2）用40%饱和度的硫酸铵处理SOD粗提液，既可以去除更多的杂蛋白又可保留较多的酶，此时SOD的比活为8.301×10-6kat/mg。经过进一步透析、DEAE-纤维素-柱层析纯化后，酶的纯化程度可达4.662×10-5kat/mg蛋白，总酶活回收率43.7%，纯化倍数26.4。

3）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析显示SOD主要由2个亚基组成。

4）H2O2和KCN对绿豆芽SOD活力的抑制结果说明绿豆芽SOD为Cu，Zn-SOD。

5）包埋剂聚丙烯酰胺凝胶浓度为22.5%时，固定化酶的结合效率达87.0%，固定化酶的活力回收达80.9%。

[1] 王爱国,罗广华,邵从本,等.大豆种子超氧化物歧化酶的研究[J].植物生理学报,1983,9(1)：77-83

[2] 陈钧辉,陶力,李俊,等.生物化学试验[M].3版.北京：科学出版社,2007：63-64

[3] 余旭亚,赵声兰,李涛,等.仙人掌超氧化物歧化酶的分离纯化及鉴定[J].云南化工,2000,27(3)：17-19

[4] 周诗毅.包埋法固定及固定化酶性质的研究.华中师范大学学报[J].2005,39(1)：97-99

[5] 静天玉,赵晓瑜.用终止剂改进超氧化物歧化酶邻苯三酚测活法[J].生物化学和生物物理进展,1995,22(1)：84

[6] 邹国林,罗时文,裘名宜.小白菜线粒体锰超氧化物歧化酶的纯化和性质研究[J].生物化学与生物物理学报,1992,24(2)：180-183