长木蜂蜂粮中10-羟基-2-癸稀酸测定及功能活性研究

贺春玲，张淑霞，嵇保中

(1.河南科技大学林学院，河南洛阳 471003;2.河南出入境检验检疫局，河南洛阳 471000;3.南京林业大学森林环境学院，南京 210037)

10-羟基-2-癸烯酸((E)-10-hydrox-2-decylenic acid，简称10-HDA)又称王浆酸，是一种不饱和脂肪酸，是蜂王浆中含有的特殊高效生物活性物质(陈盛禄，2001;洪梅和史伯伦，2001;刘晓华和孙文基，2004)。10-HDA 主要由蜜蜂工蜂的上颚腺分泌，另外，从不同蜂产品中也检测到10-HDA 的存在，意大利蜜蜂幼虫体内含有少量的10-HDA(李全阳，1999);蜂胶中10-HDA 平均含量为0.22%(潘建国等，2005)。从微生物中选育出产10-HDA 菌株，并通过改良产10-HDA 能力不稳定的微生物菌株，提高其产10-HDA 的能力(王腾飞等，2006;王海燕，2008)。10-HDA 有多种生理活性，它具有抗菌、灭菌、强壮机体和强烈抑制淋巴癌、乳腺癌等多种癌细胞的作用，还有增强机体免疫功能等功能(Townsend et al.，1960;倪辉等，2006;贺春玲等，2007;王文凤等，2007;黄盟盟，2010;陶文卿，2012)。袁耀东(1991)报道工蜂在采集花粉过程中，向花粉粒中分泌10-HDA，使花粉迅速丧失了发芽力。

在蜂粮酿制过程中，蜂粮中的花粉会很快失去萌发力，从而提高蜂粮的保质期。苏松坤等(2002)采用氯化三苯基四氮唑(TTC)花粉活性测定法测定蜜蜂茶花粉蜂粮样品中花粉粒的活力。随酿制时间的延长花粉逐渐失去活力，在第5 d 花粉生活力完全失去活性。文献报道蜂粮中花粉失去萌发力是因为在蜜蜂酿贮蜂粮的过程中加入了唾腺分泌物10-HDA，在10-HDA 的作用下花粉粒很快丧失了发芽力(袁耀东，1991);10-HDA对植物的花粉萌发、花粉管伸长和生殖核的有丝分裂有强烈的抑制作用(许雅香等，2000);但是，茶花粉蜜蜂蜂粮中没有检测到10-HDA(苏松坤，2000)。贺春玲等(2010)报道长木蜂Xylocopa tranquebarorum 蜂粮在酿制过程中花粉活力随酿制时间延长而逐渐失去活力，在1 日龄蜂粮中花粉活力相比手采花粉明显下降，3 日龄后均失去萌发力，并且不同的花粉蜂粮其花粉活力表现一致，本文为进一步明确长木蜂蜂粮中有无10-HDA的存在及其担负的功能进行研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 长木蜂蜂花粉和蜂粮样品

在南京情侣园花卉公园采集芍药长木蜂蜂粮。芍药花粉蜂粮的采集方法同贺春玲等(2010)。

1.1.2 不同植物花粉的采集

2008年3月下旬至2008年5月下旬，在南京情侣园花卉公园，在植物的盛花期采集已经盛开的植物花粉(长木蜂酿贮蜂粮盛期采访植物的新鲜花粉)，用无菌的镊子取其花粉放入灭菌的5 mL离心管中，低温条件下带回实验室，4℃保存备用。主要采集的植物花粉有:二月兰Orychophragmus violaceus、紫藤Wisteria sinensis、芍药Paeonia lactiflora。

1.1.3 试剂和仪器

试剂:10-羟基-2-癸烯酸(中国药品生物制品鉴定所)。

仪器:多功能型全自动菌落/显微图像分析仪(杭州迅数科技有限公司);

1.2 方法

1.2.1 芍药花粉、芍药长木蜂花粉和不同日龄的蜂粮样品处理

称取芍药花粉、不同时间(2007年和2008年)的芍药长木蜂蜂粮样品各0.2 g，分别放入甲醇溶液中用玻璃匀浆器研磨，研磨后的样品放入10 mL 的离心管中，用无水甲醇定容至5 mL，超声提取10 min，以10000 r/min 离心10 min，取上清液;连续离心三次，合并上清液，用氮吹仪挥去甲醇，待测定用。

1.2.2 标准品处理和色谱条件

标准品:称取0.0067 g 10-HDA 对照品，用色谱甲醇溶解至0.5 mL，再取20μL 稀释100 倍后备用。

样品:提取的样品用色谱甲醇定溶至0.5 mL，

高效液相色谱柱:Zorbax SB C18 150×4.6，3.5μm;采用反相液相色谱，流动相:水(0.1%TFA)∶甲醇(7∶3);柱温:室温;检测波长:213 nm;流速:0.8 mL/min;进样量:标准品为1 mL，样品为20 mL;采用外表法定量，内标法定性。

1.2.3 10-HDA 对花粉萌发的抑制作用

营养液为20%蔗糖+0.01%硼酸。在培养液内添加HDA，配成1250μg/mL、625μg/mL、312.5μg/mL、156.2μg/mL、78.1μg/mL 五个浓度梯度。将配制好的不同浓度梯度的培养液用移液枪取200μL 滴人灭菌凹面载玻片的凹槽内，将不同样品的花粉均匀地洒在培养液上，放在无菌的培养皿中，25℃恒温箱内保湿培养12 h，观察不同时间花粉萌发和花粉管生长情况，统计萌发率。每处理2个重复，每个重复随即观察5个视野。两次重复的平均值为该处理的抑制率。抑制率=(对照组萌发率-处理组的萌发率)/对照组的萌发率×100%

1.3 数据采集与分析

采用多功能型全自动菌落/显微图像分析仪(杭州迅数科技有限公司生产)进行数据采集;采用Microsoft Excel 和SPSS Base Ver.13.0 统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 蜂粮中10-HDA 的测定

10-HDA 标准品在恒溶剂系统中保留时间为8.367 min，蜂粮样品在8.365 min 时出现一个峰，并且通过内标法显示在标准品和蜂粮样品混合样品中在8.379 min 时出现一个峰，在该峰的前后没有其它峰，初步确定在蜂粮样品中有10-HDA 的存在。同样的方法，在芍药花粉中没有检测到10-HDA(图1)。

图1 蜂粮中10-HDA 的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of 10-HDA content in bee bread

2.2 10-HDA 对花粉萌发的抑制作用

2.2.1 10-HDA 对二月兰花粉的抑制作用

10-HDA 对二月兰花粉的萌发有非常显著的抑制作用，在含有156.25μg/mL 10-HDA 的培养液上，其抑制率达70%以上，10-HDA 抑菌率几率值与浓度对数之间的线性方程为y=1.6154x+1.8141(r2=0.9891)，EC50为93.81μg/mL(表1)。

2.2.2 10-HDA 对紫藤花粉的抑制作用

10-HDA 对紫藤花粉的萌发有显著的抑制作用，在含有625μg/mL 10-HDA 的培养液上，其抑制率达76%以上，10-HDA 抑菌率几率值与浓度对数之间的线性方程为y=1.7953x+1.0923(r2=0.9301)，EC50为150.18μg/mL(表2)。

表2 10-HDA 对紫藤花粉萌发的影响Table 2 The effect of 10-HDA on the pollen germination ratio of Wisteria sinensis

2.2.3 10-HDA 对芍药花粉的抑制作用

10-HDA 对芍药花粉的萌发有明显的抑制作用，在含有312.5μg/mL 10-HDA 的培养液上，其抑制率接近70%，10-HDA 抑菌率几率值与浓度对数之间的线性方程为y=1.6592x+1.4881(r2=0.9871)，EC50为130.81μg/mL(表3)。

2.3 10-HDA 对不同花粉的花粉管生长的影响

10-HDA 对二月兰、紫藤、芍药花粉的花粉管生长均有明显的抑制作用(表4)。在供试的10-HDA浓度梯度下，随着10-HDA 浓度的增加对花粉管的生长抑制表现明显;对不同花粉的花粉管生长的抑制作用不同，二月兰花粉的花粉管生长情况表现为10-HDA 各处理和对照之间表现出明显差异，而不同10-HDA 浓度梯度之间花粉管的生长没有显著差异;紫藤花粉和芍药花粉的花粉管生长情况均表现为10-HDA 各处理和对照之间有明显差异，且10-HDA 不同浓度梯度之间花粉管的生长也有显著差异。

表3 10-HDA 对芍药花粉萌发的影响Table 3 The effect of 10-HDA on the pollen germination ratio of Paeonia lactiflora

表4 10-HDA 对不同花粉样品花粉管生长的影响Table 4 The effect of 10-HDA on the pollen tube growth of different pollen samples

3 结论与讨论

10-HDA 主要分泌于蜜蜂工蜂的上颚腺。不同日龄的工蜂上颚腺分泌10-HAD 的能力不同，刚出房的工蜂上颚腺中含量极微，随着日龄的增加，含量有增加的趋势，15-20 日龄哺育蜂的上颚腺中含量最高，20 日龄以后开始有降低的趋势，在蜂群大繁殖期含量极高，而外勤蜂上颚腺中的10-HDA 含量则极低(李全阳，1999;荆战星，2010);长木蜂属于野生蜜蜂，雌蜂没有职能上的分工，越冬的雌蜂担负筑巢、采集花粉制作蜂粮并产卵(贺春玲等，2009)。在研究过程中，我们解剖长木蜂雌蜂的上颚腺和咽下腺，并初步采用高效液相法测定10-HDA 的有无，结果在上颚腺没有检测到10-HDA，而在咽下腺中检测到10-HDA，因检测结果与蜜蜂的研究结果不同，还有待进一步进行测定和验证。在解剖不同日龄的长木蜂雌蜂腺体，也发现腺体的饱满程度有区别，其分泌活性有无差别还有待进一步研究。不同花源的蜂王浆样品中10-HDA 的含量也不同(罗莉萍等，2006)，是否因为不同地区蜜源不同对蜜蜂工蜂分泌能力有影响，也有待进一步研究。

蜜蜂在采集花粉上分泌唾腺分泌物，唾腺分泌物中含有的王浆酸(10-羟基-2-癸烯酸)，使花粉迅速丧失发芽力(袁耀东，1991)。但苏松坤(2000)在茶花粉蜜蜂蜂粮中未检测到10-HDA，花粉活力随蜂粮酿制过程而迅速失去活力。贺春玲等(2010)测定紫藤花粉的长木蜂蜂粮和芍药花粉的长木蜂蜂粮中的花粉活力，测定结果表明在1 日龄蜂粮中花粉活力明显下降，3 日龄后均失去萌发力，并且不同的花粉蜂粮其花粉活力表现一致。本文采用高效液相色谱法检测到芍药花粉中没有10-HDA，长木蜂蜂粮有10-HDA。通过采用10-HDA 的标准品在不同浓度下对花粉萌发抑制作用测定结果看，发现10-HDA 对花粉萌发和花粉管生长起到抑制作用，初步推测长木蜂蜂粮中花粉萌发的抑制作用与10-HDA 的存在有关。长木蜂蜂粮中抑制花粉萌发的因素还有待进一步研究。长木蜂属于野生蜂类，10-HDA 的分泌能力以及分泌场所与家养蜜蜂是否一致，还有待进一步研究。关于家养蜜蜂和野生蜜蜂腺体活性成分之间的差异未见文献报道，有待在后续的研究工作中通过可靠的理论去证实。

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