除草剂硝磺草酮对四尾栅藻和微囊藻的毒性研究

倪 妍，赖劲虎，陈连水，万金保*

(1.南昌大学 环境与化学工程学院/鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室，江西 南昌 330047;2.东华理工大学 生物系，江西 抚州 344000)

硝磺草酮［(2-(4-甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰)环己烷-1，3-二酮，Mesotrione］属三酮类除草剂，主要用来防治玉米地中阔叶杂草及禾本科杂草。其具有触杀作用、持效性和后茬作物危害小的特点，一直在欧洲国家大面积使用，近些年开始进入中国市场［1］。硝磺草酮起初是用化学方法从美国加州的桃金娘科(Myrtaceae)红千层(Callistemon citrinus)中分离出来的一种挥发性油类植物毒素纤精酮(Leptospermone)，能通过抑制羟基苯基丙酮酸酯双氧化酶(p-HPPD)来影响植物的光合作用［2］。而p-HPPD 是将酪氨酸转化成质体醌和生育酚的重要物质［3］。硝磺草酮在水中的溶解度为0.16 mg/mL(20 ℃)，在土壤中的降解半衰期为3～32 d，吸附常数Kd为0.12～5.0 L/kg，这种物理化学特性使其在土壤中的移动性较强，较容易污染地表水和地下水［4］。硝磺草酮进入水环境后，在自然光照射下比较稳定，降解半衰期长达84 d［5］。较长的半衰期使硝磺草酮残留对水体中非靶生物产生潜在危害，如降低黑麦草(Lolium perenne L.)的光化学效率，降低梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)的非特异性酯酶活性和费氏弧菌(Vibrio fischeri)的新陈代谢活性［6-8］。

藻类是水生态系统的初级生产者，对维持水生态系统结构和功能的稳定具有重要意义。藻类具有个体小、代谢周期短、对有毒有害化合物敏感等特点，在较短时间内可得到化学物质对藻类世代及种群水平的影响评价，是较理想的测试生物［9-11］。近年来，国内外关于除草剂对藻类的毒性研究已有大量报道，如蔡卫丹等［12］在对映体水平上研究了异丙甲草胺对斜生栅藻和普通核小球藻的急性毒性;Sabater等［13］对比了苄嘧磺隆和醚磺隆对四种淡水微藻生长的影响;Ma 等［14］研究了7 种除草剂对3 种蓝藻的敏感性差异。但关于硝磺草酮对微藻的毒性研究鲜见报道。本研究拟选取蓝藻水华常见有害藻种微囊藻(Microcystis sp.)和常见绿藻四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)为毒性指示生物，用急性毒性法分析并比较了10%硝磺草酮悬浮剂和硝磺草酮标准品对两种淡水微藻的毒性差异，探讨硝磺草酮对水体非靶生物的潜在危害，以期为这种新兴除草剂的合理使用及生态风险评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻细胞培养

实验藻种四尾栅藻(FACHB-1297)和微囊藻(FACHB-562)均购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库。10%硝磺草酮悬浮剂购自大连松辽化工有限公司，硝磺草酮标准品(CAS 104206-82-8，纯度99.0%)购自德国Dr.Ehrenstorfer。四尾栅藻和微囊藻均于BG-11［15-16］培养液(pH 7.1)中扩大培养数周，在无菌条件下反复转接3 次以上，待达到同步培养后取对数生长期的藻细胞进行实验。培养条件为温度(25±1)℃，光照度80 μmol/(m2·s)，光暗比12∶12。

1.2 急性毒性实验

将10%硝磺草酮悬浮剂和标准品分别配制成1 g/L 的母液，用BG-11 培养液将母液稀释至终浓度0.05，0.2，0.5，2，5，10 mg/L，每个浓度设置3 个平行，并设置一组空白对照。将藻液接种至含不同浓度硝磺草酮的100 mL 培养液中，四尾栅藻的初始藻细胞量为1.6×105～2.4×105cells/mL，微囊藻的初始藻细胞量为2.3×105～3.0×105cells/mL，每天定时摇动3 次，并随机更换锥形瓶位置，使光照均匀。培养期间每天用血球计数板进行计数测定细胞密度。

取10 mL 藻液，8 000 r/min 离心10 min 收集藻细胞，加入5 mL 90%丙酮后4 ℃避光提取24 h，离心后收集上清液为提取液，以90%丙酮为参比，用光径为1 cm 的比色杯在750，663，645，630 nm 波长处测OD 值。校正后叶绿素a 含量按以下公式计算:

1.3 数据统计分析

数据采用SPSS 软件(IBM SPSS Statistics 19)进行单因素方差(ANOVA，LSD 检验)分析和处理，P＜0.05认为差异显著。生长抑制率通过(对照组细胞密度-处理组细胞密度)/对照组细胞密度×100%计算后，采用Logistic model［17］计算其半效应浓度(EC50)值。叶绿素a 抑制率通过(对照组叶绿素a 含量-处理组叶绿素a 含量)/对照组叶绿素a 含量×100%计算。作图采用SigmaPlot 10.0。

2 结果与讨论

2.1 硝磺草酮对四尾栅藻生长的影响

用不同质量浓度的硝磺草酮商品分别处理四尾栅藻培养液，以藻细胞密度为生长指标，其对四尾栅藻生长的影响见图1A。与对照组相比，0.05～10 mg/L 的硝磺草酮对四尾栅藻呈不同程度的抑制，且存在明显的剂量-效应关系。

图1 硝磺草酮商品(A)及其标准品(B)对四尾栅藻生长的对比影响Fig.1 Effects of commercial(A)and analytical standards(B)mesotrione on growth of Scenedesmus quadricauda

暴露第2 天，高浓度组(＞0.2 mg/L)藻细胞数量急剧减少(P＜0.05)，随后细胞密度缓慢上升，这可能与四尾栅藻自身的抗性增强，在硝磺草酮的胁迫下有一定的恢复能力有关。直至暴露第5 天，高浓度组(＞0.2 mg/L)藻细胞密度仍低于接种密度，表明高浓度硝磺草酮对四尾栅藻具有较强的抑制作用。暴露在0.05～0.5 mg/L的硝磺草酮商品下，四尾栅藻培养第5 d的生长抑制率分别为11.11%、67.68%、160.61%、170.71%、172.73%和209.09%。使用不同浓度的硝磺草酮标准品处理四尾栅藻藻液作为参考，其生长曲线见图1B。与硝磺草酮商品不同，低浓度组(0.05～0.2 mg/L)对四尾栅藻的生长具有微弱的促进作用。2 mg/L 的硝磺草酮标准品开始抑制四尾栅藻的生长，且随着处理浓度的增加，抑制作用逐渐增强。暴露在2～10 mg/L 的硝磺草酮标准品下第5天，四尾栅藻的生长抑制率分别为11.07%、43.38%和47.91%(P＜0.05)。

显微观察发现，四尾栅藻在硝磺草酮商品处理下暴露1 d 后出现聚集，且聚集程度与硝磺草酮浓度呈正相关，这种现象与斜生栅藻在毒死蜱处理下细胞体积增大，形态改变，子细胞分裂畸形，出现人字形和裤型相似［18］。可能是浮游植物抵御有害环境胁迫、保护自身的方式。

2.2 硝磺草酮对微囊藻生长的影响

图2 硝磺草酮商品(A)及其标准品(B)对微囊藻生长的对比影响Fig.2 Effects of commercial(A)and analytical standards(B)mesotrione on growth of Microcystis sp.

用不同质量浓度(0.05～10 mg/L)的硝磺草酮商品分别处理微囊藻培养液，其对微囊藻生长的影响见图2A。与对照组相比，硝磺草酮商品无论浓度高低对微囊藻均呈抑制作用，且抑制程度与其浓度呈正相关。暴露第5 天，微囊藻随硝磺草酮商品浓度的递增依次被抑制19.75%、17.28%、98.77%、109.88%、130.86%和172.84%。与硝磺草酮商品不同，不同水平的硝磺草酮标准品对微囊藻生长的影响呈现低浓度(0.05～0.2 mg/L)促进、高浓度(＞2 mg/L)抑制趋势(图2B)。由图1 和图2 对比得知，硝磺草酮标准品的毒性远低于商品(P＜0.05)，可能由于硝磺草酮商品中含有溶剂与乳化剂等助剂，这些助剂对藻类也具有潜在危害。这与Ma 等［19］研究结果一致，农药助剂对四尾栅藻和普通小球藻的生长也具有抑制作用，且抑制程度与藻种和助剂类型有关。

微囊藻的生长曲线比四尾栅藻的更平缓，藻细胞未出现聚集和急剧死亡，表明微囊藻对硝磺草酮商品及其标准品的敏感性低于四尾栅藻，与Fairchild 等［20］研究结果一致，蓝藻的敏感性低于绿藻。藻类不同的敏感程度在其他除草剂处理下也有出现，如暴露在草甘膦下，栅藻比小球藻敏感，丝藻比微囊藻敏感［21-22］。这种敏感性差异与藻类的细胞大小、结构差异，以及分泌物和酶的不同，使藻细胞对有毒物质的亲和性不同有关［23］。一般而言，暴露在相同的农药下，绿藻和硅藻的敏感性高于蓝藻［20，24］。这种敏感性差异导致群落中的敏感种逐渐被抗性种替代，群落组成发生变化［22］。这一结果提示，水体中硝磺草酮残留可能改变藻类群落的优势种，对蓝藻水华的爆发起着促进作用。

2.3 硝磺草酮对四尾栅藻和微囊藻的急性毒性

表1 为硝磺草酮商品及其标准品对四尾栅藻和微囊藻的24，48，72，96 h 的EC50值。由表1 可知，硝磺草酮商品及其标准品对两种藻的毒害效应不同，对微囊藻的毒性较小，EC50值大于相同暴露时间的四尾栅藻的EC50值。随着暴露时间的延长，四尾栅藻的EC50值总体呈下降趋势，毒性越来越大，但在72 h上升，表明该藻在72 h 对硝磺草酮有一定的抗性。微囊藻并未显示出类似的抗性，其毒性随着时间的延长增加。总体上，硝磺草酮商品及其标准品对两种藻的毒性都随着暴露时间的增加而增强。硝磺草酮商品及其标准品对微囊藻的EC50，24h、EC50，48h、EC50，72h分别是对四尾栅藻EC50值的1.87、1.67、1.18倍和1.43、1.28、0.98 倍，两者的差异性随暴露时间的延长而减小，在暴露初期最为明显。

表1 硝磺草酮商品及其标准品对四尾栅藻和微囊藻的急性毒性Tab.1 Acute toxicity of commercial and analytical standards mesotrione on Scenedesmus quadricauda and Microcystis sp.

硝磺草酮作为阿特拉津的替代品，与阿特拉津对四尾栅藻和微囊藻的96 h EC50值0.04 mg/L、0.09 mg/L相比，硝磺草酮标准品对两者的96 h EC50值更大，表明硝磺草酮的生物毒性比阿特拉津低，其水体残留对水生生物的影响比阿特拉津小［20，25］。硝磺草酮对水生生物毒性大小因受试生物物种不同而有一定差异，对浮生植物浮萍的EC50值为0.04 mg/L，对原核生物费氏弧菌的LC50值为69.2 mg/L，对原生动物梨形四膜虫的LC50值为322.7 mg/L［8，26］。而硝磺草酮对月芽藻的EC50值为7.81 mg/L［26］，与本实验结果相似。因此，藻类对硝磺草酮的敏感性低于浮生植物，高于原核生物和原生动物。硝磺草酮标准品的EC50值远高于商品的EC50值，可能由于市售硝磺草酮农药为提高药效和安全施药添加的磷酸酯、非离子及阴离子表面活性剂本身也具有一定毒性［27］。因此，使用商品农药和标准品对比研究其毒性效应能使该农药对生态环境影响的评估更为全面。

2.4 硝磺草酮对四尾栅藻和微囊藻叶绿素a 含量的影响

图3 硝磺草酮商品及其标准品对四尾栅藻(A)和微囊藻(B)叶绿素a 的抑制百分率Fig.3 Inhibition rate of chlorophyll a of Scenedesmus quadricauda(A)and Microcystis sp.(B)under commercial and analytical standards mesotrione exposure

叶绿素是光合作用中参与吸收、传递光能的关键物质，是描述藻类将无机物质转变为有机物质能力的重要指标。用不同质量浓度的硝磺草酮商品和标准品处理四尾栅藻和微囊藻培养液，随时间的延长，叶绿素a 含量变化与其生长曲线相似(数据未列出)，暴露第5 天，2 种藻叶绿素a 的抑制百分率见图3A、3B。硝磺草酮对2 种藻细胞叶绿素a 含量的影响与硝磺草酮剂量相关，随着浓度的增加，四尾栅藻和微囊藻的叶绿素a 抑制率均增大。在硝磺草酮商品处理下，与对照组相比，四尾栅藻和微囊藻叶绿素a 抑制率分别为27.8%～91.2%和27.2%～81.3%。而这2 种藻的叶绿素a 抑制率在硝磺草酮标准品处理下更低，分别为1%～51.2%和3.6%～52.6%。硝磺草酮商品的毒性高于标准品的毒性，这与其对2 种藻生长的影响结论一致。Valiente 等［28］研究结果也表明，0.02 mg/L 的硝磺草酮降低了四尾盘星藻细胞内的叶绿素a 含量。与本研究中硝磺草酮能使四尾栅藻和微囊藻的叶绿素a 含量降低吻合。叶绿素a 含量降低的原因可能由藻细胞密度降低或者单细胞内叶绿素a 含量减少引起。而后者可能由于叶绿体片层中捕光Chla/b-Pro 复合体合成受到抑制，使细胞内的叶绿素合成受阻［29］。

3 结论

0.05～10 mg/L 的硝磺草酮商品及其标准品对四尾栅藻和微囊藻的生长均呈抑制作用，且存在显著的剂量-效应关系。硝磺草酮商品的毒性远高于标准品，可能与商品中添加助剂有关。四尾栅藻对硝磺草酮的敏感性高于微囊藻，敏感性差异随暴露时间的延长而减小，在暴露初期最为明显。暴露第5天，四尾栅藻和微囊藻叶绿素a 抑制率在硝磺草酮商品处理下为27.8%～91.2%、27.2%～81.3%;在硝磺草酮标准品处理下为1%～51.2%、3.6%～52.6%。

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