Tim-3及其配体Gal-9与宫颈鳞状细胞癌病理分级和预后的相关性研究

徐国荣 冯秀兰 许作鹏

1.江门市人民医院妇科，广东江门 529000；2.江门市人民医院检验科，广东江门 529000；3.江门市人民医院病理科，广东江门 529000

T 细胞免疫球蛋白黏蛋白家族（Tim family）是一类参与调节机体免疫的关键分子，自发现以来，其功能受到广泛关注。目前人们研究比较多的Tim 分子主要是Tim-1，Tim-3，Tim-4,等，其中Tim-3 因其在抗肿瘤免疫方面的作用而被重视[1]。越来越多的研究发现，Tim-3 表达于多种肿瘤相关的免疫细胞，且其表达水平和功能各异，主要是通过参与T 细胞功能障碍或是耗竭以及扩增髓系来源移植细胞增殖等在肿瘤免疫中其着负向调控作用[2]。而半乳凝素9（Gal-9）作为Tim-3 的特异性配体，与Tim-3 一起调控机体抗肿瘤的免疫应答[3]。

在发展中国家，宫颈鳞状细胞癌（SCC）在女性恶性肿瘤中位居第2 位，仅次于乳腺癌，严重威胁着妇女的健康。该研究应用Western blot、qRT-PCR 以及ELISA 技术，探究Tim-3 及其配体Gal-9 在不同分化宫颈鳞癌中的表达，从而为临床寻找有意义的检测指标。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经患者知情同意，收集江门市人民医院2012年6月—2014年6月就诊宫颈鳞状细胞癌（SCC）患者组织及血清样本共38例，根据组织病理学分级，其中低分化癌（PSCC）11 例，中分化癌（MSCC）12 例，高分化癌（WSCC）15 例，依次设为PSCC 组、MSCC组以及WSCC 组。收集同期来诊上皮瘤样病变（CIN）患者组织及血清样本共17 例以及健康妇女血清样本共17 例，分别设为CIN组以及正常组。其中正常组、CIN 组、PSCC 组、MSCC 组、WSCC 组患者平均年龄分别为41±3.2、41.5±2.3、40±2.0、41±2.5、43±3.0岁，各组年龄经t 检验分析，差异无统计学意义（P>0.05），各组患者术前均未经过放化疗。

1.2 方法

1.2.1 癌组织样本中Tim-3 及Gal-9 表达检测 采用Western blot 技术检测CIN 组、PSCC 组、MSCC 组、WSCC 组组织样本中Tim-3 以及Gal-9 蛋白的表达。分别取各组组织样本100mg，采用IM-PER 蛋白抽提试剂（购自Therrmo 公司）抽提蛋白，通过BCA 蛋白浓度定量试剂盒（购自Thermo 公司）进行定量，定量蛋白上样后进行电泳及转膜，分别采用抗Tim-3 抗体以及抗Gal-9抗体对硝酸纤维素膜进行第1 次孵育，分别采用HRP 标记的相应抗体进行二次孵育，采用荧光化学法显色，观察结果；采用qRT-PCR 检测CIN 组、PSCC 组、MSCC 组、WSCC 组组织中Tim-9 以及Gal-9 的表达。取各组组织样本100 mg，采用TRIZOL 法抽提组织样本总RNA，经一步法反转录试剂盒（购自Takara 公司）进行反转录PCR 后，采用SYBRR 荧光定量试剂进行qRTPCR 进行定量检测。以上检测均以GAPDH 作为内参，以CIN 组作为对照组，其中qRT-PCR 引物序列如下：

Tim-3 正义：5'-CAGATACTGGCTAAATGGGGAT-3'，

反义:5'-ACCTTGGCTGGTTTGATGAC-3'；

Gal-9 正义：5'-AATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG-3'，

反义：5'-CTATGTCTGCACATGGGTCAG-3'；

GAPDH 正义：5'-TGACCACAGTCCATGCCATC-3'，

反义：5'-GACGGACACATTGGGGGTAG-3'

1.2.2 血清中Gal-9 的表达检测 采用ELISA 检测正常组、CIN组、PSCC 组、MSCC 组、WSCC 组血清中Gal-9 的表达量，取各组外周血进行30 min 2 000 rpm 离心，取上清采用ELISA 试剂盒（购自R&D 公司）进行Gal-9 浓度检测。

1.3 统计方法

通过GraphPad prism 5.0 软件，采用t 检验分别计算Tim-3及其配体Gal-9 在组间表达差异性分析。通过SPSS 17.0 软件，采用spearman 检验分别计算Tim-3 以及Gal-9 与不同病理分级的宫颈鳞状细胞癌之间相关性。

2 结果

2.1 Tim-3 在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

Western blot 结果显示，在宫颈鳞状细胞癌组织中Tim-3 的表达比CIN 高，并且，Tim-3 表达量随着病理分级的改变而改变，具体表现为WSCC 较MSCC 高，MSCC 较PSCC 高（图1，A）。通过qRT-PCR 我们在mRNA 水平上加以验证，也得到了同蛋白水平相似的结果，即Tim-3 的表达在SCC 中较高，差异有统计学意义（P<0.05），且由PSCC 至WSCC 逐渐上调，差异有统计学意义（P<0.05）（图1，A）。

图1 Tim-3 在CIN 组、PSCC 组、MSCC 组、WSCC 组组织中的表达。A，Western blot 检测Tim-3 在各组组织中的表达；B，qRT-PCR 检测Tim-3 在各组组织中的表达，*P<0.05

2.2 Gal-9 在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达

实验结果显示，Gal-9 的表达与Tim-3 的表达变化高度相似。其中，Western blot 结果显示，Gal-9 在SCC 组织中表达高于CIN，且由PSCC 向WSCC 逐步递增（图2，A）。通过qRT-PCR 我们对结果进一步验证发现，Gal-9 在SCC 中较CIN 表达上调，差异有统计学意义（P<0.05）,且其表达随着癌组织分化程度增高而上调（图2，B）。

图2 Gal-9 在CIN 组、PSCC 组、MSCC 组、WSCC 组组织中的表达。A，Western blot 检测Tim-3 在各组组织中的表达；B，qRT-PCR 检测Tim-3 在各组组织中的表达，*P<0.05。

2.3 血清中Gal-9 的表达量与病理分级的相关性

ELISA 结果显示，SCC 患者血清中Gal-9 表达量较正常以及CIN 高，差异有统计学意义（P<0.05），在不同病理分级中，Gal-9的表达量随癌组织分化程度增加而增加，且各级间差异有统计学意义（P<0.05）（图3）。spearman 秩相关系数，r=0.687 显示血清中Gal-9 表达量与癌组织分化程度呈现明显正相关性。

图3 ELISA 检测各组血清中Gal-9 的表达量，*P<0.05。

2.4 组织中Tim-3 和Gal-9 基因表达与病理分级的相关性

进一步分析qRT-PCR 数据显示，宫颈鳞状细胞癌病理分级与Tim-3 和Gal-9 基因表达差异有统计学意义（P<0.05），spearman秩相关系数，分别是0.738 和0.671,说明病理分级与Tim-3 和Gal-9 基因表达均呈现明显正相关。这与Gal-9 在血清中的表达量与病理分级的相关性一致。

3 讨论

Tim-3 作为一种抗肿瘤的负向调控因子，在调控多种肿瘤凋亡过程中起着重要作用[4]。目前研究报道，Tim-3 在前列腺癌、肾癌、急性白血病以及黑色素瘤等多种癌组织中呈强阳性表达[5-8]。对于宫颈鳞状细胞癌中Tim-3 的表达以及Tim-3 的表达与宫颈鳞状细胞癌病理分级的相关性则仍未有报道。该研究中，Western blot 与qRT-PCR 结果均显示Tim-3 在SCC 各组组织中表达高于CIN 组（P<0.05），说明Tim-3 在SCC 中表达，且作为机体抗肿瘤因子在宫颈鳞癌发生过程中可能起着重要作用，关于其作用机制尚需进步一研究。进一步分析Tim-3 的表达与病理分级的关系，发现Tim-3 表达在PSCC、MSCC、WSCC 3 组中有明显差异（P<0.05），且与病理分级呈现明显的正相关性（r=0.738），两者的关系揭示了Tim-3 可以作为临床宫颈鳞状细胞癌病理分级一个重要指标，为宫颈鳞状细胞癌的预后提供一个有意义的参考指标。

该研究又对Tim-3 的特异性配体Gal-9 的表达进行了进一步研究。Gal-9 是Tim-3 的主要配体，与Tim-3 一同在抗肿瘤免疫起着重要的负向调控作用[9]。已有文献报道称血清中Gal-9的表达量与宫颈鳞状细胞癌的病理分级呈现正相关关系[10]，但并未在基因表达水平进步一验证，且研究过于简单，没有深入验证。首先该研究通过Western blot 验证了Gal-9 在SCC 中的表达，发现相比CIN 组，Gal-9 在SCC 各组中均呈强阳性表达，预示作为Tim-3 的特异性配体Gal-9 可能在癌症发展过程中起着重要的调控作用，而在SCC 各组表达呈现由低分化癌向高分化癌递增的现象表明Gal-9 可能与病理分级呈正相关关系。接下来通过qRT-PCR 在mRNA 水平进一步验证分析，得到了与Western blot 相似的结果，分析数据发现组织中Gal-9 的表达与癌组织分化程度确实呈现显著正相关性（r=0.671，P<0.05）。最后我们在血清中对Gal-9 的表达与病理分级的正相关性做了进一步验证，ELISA 结果显示，SCC 血清中Gal-9 浓度明显高于正常妇女以及CIN 组，且差异有统计学意义（均为P<0.05），在不同病理分级下，亦由PSCC 至WSCC 呈现明显递增关系（r=0.687）。说明Gal-9 无论是在组织中蛋白和mRNA 表达量还是分泌至外周血中的表达量，均比正常组以及CIN 组高且与病理分级呈正相关关系，可以与Tim-3 一同作为病理分级以及预后的指标。

综上所述，癌组织的分化程度越高，说明恶性程度越低，而Tim-3 以及Gal-9 与病理分级呈现明显正相关性，也从侧面揭示了Tim-3 及其配体Gal-9 在抗肿瘤过程中可能起着重要的调控作用，关于两者的作用机制，需要进一步研究。该研究中Tim-3及其配体Gal-9 的表达与宫颈鳞状细胞癌的病理分级的这种正相关性关系可以作为宫颈鳞状细胞癌病理分级的指标，为提高预后提供参考依据。

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