表没食子儿茶素没食子酸酯和补骨脂对莫诺苯宗诱导白癜风样小鼠的影响

王翠 祝逸平 许爱娥

表没食子儿茶素没食子酸酯和补骨脂对莫诺苯宗诱导白癜风样小鼠的影响

王翠 祝逸平 许爱娥

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和补骨脂对莫诺苯宗诱导的白癜风样小鼠的影响。方法C57BL/6小鼠40只,脱去背部2 cm×2 cm区域毛,随机分为4组,每组10只。阴性对照组涂抹凡士林乳膏;模型组涂抹40%莫诺苯宗乳膏;EGCG组先后涂抹5%EGCG、40%莫诺苯宗乳膏;补骨脂组先后涂抹7%补骨脂、40%莫诺苯宗乳膏。观察小鼠皮肤和毛发脱色情况,组织病理检查观察淋巴细胞浸润,免疫荧光检测CD8+T细胞表达量。结果阴性对照组小鼠皮肤和毛发无脱色现象。模型组小鼠在用药部位及非用药部位均有脱色现象,EGCG组和补骨脂组小鼠用药部位全部出现脱色,用药部位出现脱色斑的平均时间分别为16.7、29.3和19.9 d,脱色面积指数分别为4.00±0.00、2.11±0.54、2.84±0.79,EGCG组、补骨脂组和模型组之间脱色面积指数差异有统计学意义(F=14.17,P＜0.05),EGCG组和补骨脂组分别与模型组比较,脱色面积指数差异均有统计学意义(均P＜0.05);同时,EGCG组和补骨脂组非用药部位的脱色面积指数差异同样有统计学意义(P＜0.05)。EGCG组和补骨脂组CD8+T细胞表达量均低于模型组,EGCG组和补骨脂组差异亦有统计学意义(P＜0.05)。结论EGCG和补骨脂对莫诺苯宗诱导的小鼠皮肤和毛发脱色均有干预作用,EGCG的干预作用比补骨脂的干预作用强,该动物模型与人类白癜风具有极高相似性。

白癜风;没食子酸丙酯;补骨脂;疾病模型,动物

白癜风是一种自身免疫性疾病,以皮肤黏膜色素脱失为特征,其病因及发病机制尚未明确。本课题组已应用莫诺苯宗构建与人类白癜风相似性极高的动物模型[1]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)特殊的多酚化学结构使其具有很强的抗氧化、抗癌、抗突变和抗病毒等多种生物学作用[2-3]。补骨脂能促使黑素的合成。本研究通过EGCG、补骨脂干预莫诺苯宗诱导的白癜风样小鼠,进一步验证该模型与人类白癜风的相似性。

一、材料

1.动物来源:C57BL/6小鼠,雌性,体质量(15.5±2.0)g,来源于上海斯莱克实验动物有限公司[生产许可证号SCXK(沪)2007-0005,检疫合格证号:0005854]。

2.主要试剂和仪器:莫诺苯宗(美国Sigma公司)由杭州市第三人民医院制剂室制备成不同浓度乳膏,5%EGCG乳膏(中国药科大学药物科学研究院),7%补骨脂乳膏(中国药科大学药物科学研究院),10%正常山羊血清、二抗、CD8单克隆抗体(北京中杉金桥公司)。皮肤共聚焦激光扫描显微镜(RCM,美国微维VIVASCOPE 1500型,波长830 nm,最大输出16.0 mW);免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜[CLSM,Fluo View FV1000型(日本Olympus公司),波长488 nm]。

二、方法

1.分组:C57BL/6小鼠40只,随机分为阴性对照组、模型组、EGCG组、补骨脂组,每组10只,脱去小鼠背部2 cm×2 cm区域黑色毛,用刮勺稍用力涂药直至吸收。阴性对照组:每天涂抹凡士林乳膏50 mg 1次;模型组:每天涂抹40%莫诺苯宗乳膏50 mg 1次;EGCG组:每天先予以5%EGCG 50 mg 1次,间隔4 h后再予以40%莫诺苯宗乳膏50 mg 1次;补骨脂组:每天先予以7%补骨脂50 mg 1次,间隔4 h后再予以40%莫诺苯宗乳膏50 mg 1次。各组小鼠连续用药50 d,停药后连续15 d肉眼观察小鼠毛发颜色和脱色面积变化,通过RCM观察皮肤脱色情况。

2.皮肤脱色评估:每日观察皮肤脱色,并记录积分[4],计算脱色面积指数(用药与非用药部位评分合计/2)。将脱色部位分为用药部位和非用药部位,每个部位总分为5分,每只小鼠共10分。小鼠皮肤脱色评分标准为:0分皮肤无脱色:1分皮肤脱色面积0～10%;2分皮肤脱色面积11%～25%;3分皮肤脱色面积26%～50%;4分皮肤脱色面积51%～75%:5分皮肤脱色面积76%～100%。

3.毛发脱色评估:见文献[5]。

4.组织病理:实验结束后处死豚鼠,并于用药部位中心取1 cm×1 cm皮肤,用4%甲醛固定用药部位及其周围的皮肤组织,石蜡包埋切片,HE染色。

5.CLSM检测:方法见文献[5]。

6.统计学方法:应用SPSS17.0软件对数据进行分析,数据测定结果以±s表示,组间差异比较采用方差检验,两两比较采用LSD-t检验,P＜0.05认为差异有统计学意义。

三、结果

1.脱色的发生率和时间:模型组、EGCG组和补骨脂组小鼠用药部位全部出现脱色(图1a、1c、1d),非用药部位脱色斑的发生数分别为5只、2只和5只。EGCG组、补骨脂组和模型组小鼠用药部位最早出现脱色斑的时间分别为实验第23天、第17天和第15天,平均脱色时间分别为29.3 d、19.9 d和16.7 d;非用药部位出现脱色斑的开始时间分别为实验第35天、第27天和第26天,平均脱色时间分别为36 d、27.6 d和26.6 d。

图1 模型组、阴性对照组、表没食子儿茶素没食子酸酯组和补骨脂组小鼠用药部位脱色情况 1a:模型组;1b:阴性对照组;1c:表没食子儿茶素没食子酸酯组;1d:补骨脂组

2.脱色面积和稳定性:模型组、EGCG组、补骨脂组小鼠用药部位脱色面积指数分别为4.00±0.00、2.11±0.54、2.84±0.79,非用药部位分别为2.4±0.55、1.12±0.70、1.70±0.53,EGCG组和补骨脂组小鼠用药部位的脱色面积指数均低于模型组,三组之间差异有统计学意义(F=14.17,P＜0.05),EGCG组和补骨脂组间差异也有统计学意义(P＜0.05)。三组非用药部位的脱色面积指数差异同样有统计学意义(F=9.46,P＜0.05),EGCG组较补骨脂组脱色面积指数小(P＜0.05)。停药后15 d内,模型组中有1只小鼠出现少量复色,3只脱色面积有少量扩大,而EGCG组有5只小鼠出现不同程度复色,补骨脂组有3只小鼠出现复色迹象,但后两组小鼠均没有出现脱色面积扩大现象。

3.淋巴细胞浸润数量的差异:组织病理HE染色显示,EGCG组脱色斑及其周围皮肤的真皮浅层仅有少量淋巴细胞浸润,补骨脂组浸润的淋巴细胞较EGCG组多。

4.CD8+T细胞表达量差异:阴性对照组免疫荧光切片只有极少量CD8+T细胞表达,其单位面积荧光强度为61.132±2.034;模型组表达CD8+T细胞明显,为260.644±9.023;EGCG组可见极少量CD8+T细胞表达,为101.211±9.017;补骨脂组可见一些高亮CD8+T细胞表达,为192.187±10.322。后三组间CD8+T细胞表达量差异有统计学意义(F=13.44,P＜0.05),EGCG组较补骨脂组CD8+T细胞表达量少(P＜0.05)。

四、讨论

莫诺苯宗是一种皮肤脱色剂,主要通过酪氨酸酶与活性氧簇(ROS)的相互作用[6],诱导CD8+T细胞和CD4+T细胞发生反应,从而引起自身免疫反应,最终导致色素脱失[7]。因此本研究利用莫诺苯宗诱导小鼠出现白癜风样色素脱失,为探讨白癜风发病机理研究及药物开发建立合适的白癜风动物模型。

本研究观察了EGCG和补骨脂对莫诺苯宗诱导小鼠脱色的影响,结果显示,EGCG和补骨脂均有干预作用,且EGCG干预作用更强。干预作用主要表现为开始出现脱色斑时间延迟,面积缩小,非用药部位脱色斑的发生率相应降低及复色现象明显。停药后15 d内,EGCG组有5只小鼠出现不同程度复色,补骨脂组有3只小鼠有复色现象,两组均未出现扩大现象。RCM观察复色部位的皮肤,可见树突状、折光明亮的黑素细胞,这一表现与人类白癜风患者治疗后出现复色的皮肤表现一致[8]。EGCG组局部CD8+T细胞浸润明显减少,这可能与EGCG的抗氧化、抗炎作用,增强机体免疫功能,降低致炎因子的产生和分泌有关。

综上所述,本研究结果显示,EGCG和补骨脂对莫诺苯宗诱导的白癜风样小鼠具有干预作用,EGCG其干预效果明显优于补骨脂,提示EGCG可用于药物筛选研究。另外,本研究也进一步证明了莫诺苯宗诱导的白癜风样小鼠模型与人类白癜风具有共性,提示该模型可用于白癜风相关研究的动物模型。

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[4]Harris JE，Harris TH，Weninger W，et al.A mouse model of vitiligo with focused epidermaldepigmentation requires IFN-γ for autoreactive CD8+T-cell accumulation in the skin[J].J Invest Dermatol，2012，132(7):1869-1876.

[5]祝逸平，王遂泉，李阳，等.局部针刺对莫诺苯宗诱导C57BL/6小鼠白癜风样模型的影响[J].中华皮肤科杂志，2014，47(1):26-29.

[6]van den Boorn JG，Melief CJ，Luiten RM.Monobenzone-induced depigmentation:from enzymatic blockade to autoimmunity[J].Pigment Cell Melanoma Res，2011，24(4):673-679.

[7]van den Boorn JG，Konijnenberg D，Tjin EP，et al.Effective melanoma immunotherapy in mice by the skin-depigmenting agent monobenzone and the adjuvants imiquimod and CpG[J].PLoS One，2010，5(5):e10626.

[8]罗卫，马春林，吕俊卿，等.应用共聚焦激光扫描显微镜对白癜风成像的观察与研究[J].实用皮肤病学杂志，2012，5(1):9-11.

2014-03-24)

(本文编辑:周良佳 颜艳)

Effect of epigallocatechin gallate and fructus psoraleae on the induction of vitiligo-like depigmentation by monobenzone in mice

Wang Cui*，Zhu Yiping，Xu Ai′e.*Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University，Hangzhou 310009，China

Xu Ai′e，Email:xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo study the effect of epigallocatechin gallate(EGCG)andfructus psoraleaeon the induction of vitiligo-like depigmentation by monobenzone in mice.MethodsForty C57BL/6 mice were included in this study.Hairs in an area measuring 2 cm × 2 cm in size were shaved on the back of each of these mice.Then，the mice were randomly and equally divided into four groups to be topically treated with vaseline cream(negative control group)，monobenzone 40%cream(model group)，EGCG 5%cream followed by monobenzone 40%cream(EGCG group)，fructus psoraleae7%cream followed by monobenzone 40%cream(fructus psoraleaegroup)，on the shaved area，respectively，for 50 consecutive days.Depigmentation of skin and hairs was observed daily by naked eyes for 15 days after drug withdrawal.At the end of the study，all the mice were sacrificed，and skin specimens were resected from the tested regions in them.Hematoxylin and eosin(HE)staining was performed to observe lymphocyte infiltration，and immunofluorescence assay to estimate the frequency of CD8+T cells.ResultsDepigmentation was observed in monobenzone-induced and-uninduced sites in the model group，and in monobenzone-induced sites in all the mice in the EGCG group andfructus psoraleaegroup，but in neither monobenzone-induced nor-uninduced sites ih the negative control group.The average time for the appearance of depigmentation at monobenzone-induced sites was 16.7，29.3 and 19.9 days in the model group，EGCG group andfructus psoraleaegroup respectively.The depigmentation area index at monobenzone-induced sites was 4.00±0.00 in the model group，significantly different from that in the EGCG group andfructus psoraleaegroup(2.11 ± 0.54 and 2.84±0.79，bothP＜0.05).Significant differences were also observed in depigmentation area index at monobenzone-induced sites among the model group，EGCG group andfructus psoraleaegroup(F=14.173，P＜0.05)，and at monobenzone-uninduced sites betweenfructus psoraleaegroup and EGCG group(P＜0.05).The frequency(expressed as fluorescence intensity)of CD8+T cells was significantly lower in the EGCG group andfructus psoraleaegroup than in the model group，and significantly different between EGCG group andfructus psoraleaegroup(P＜ 0.05).Conclusions Both EGCG andfructus psoraleae，especially EGCG，can interfere with the induction of vitiligo-like depigmentation of skin and hairs by monobenzone in mice.The mouse model of vitiligolike depigmentaion in this study shows higher similarity to human vitiligo.

Vitiligo;Propyl gallate;PSORALEA CORYLIFOLIA;Disease models，animal

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.020

国家自然科学基金面上项目(81271758);省部共建项目基金(WKJ2012-2-036);杭州科技局重大创新项目(20122513A02);浙江省自然科学基金(LY13H110001,Y2111310)

310009杭州,安徽医科大学附属杭州临床学院(王翠);杭州市第三人民医院皮肤科(祝逸平、许爱娥)通信作者:许爱娥,Email:xuaiehz@msn.com