甘露糖结合凝集素在寻常性银屑病皮损中的表达

苏英 郭淑兰 于晓静 李春阳 孙青

·论著·

甘露糖结合凝集素在寻常性银屑病皮损中的表达

苏英 郭淑兰 于晓静 李春阳 孙青

目的检测甘露糖结合凝集素(MBL)在寻常性银屑病患者皮损中的表达,初步探讨皮肤中MBL蛋白与银屑病发病的关系。方法采用免疫组化法和Western印迹检测30例进行期寻常性银屑病患者皮损、非皮损区皮肤(皮损周围外观正常皮肤)及30例健康人对照皮肤中MBL的表达。采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,组间资料比较采用t检验。结果免疫组化检测显示,银屑病皮损区MBL呈现阳性表达(相对表达量为0.636 7±0.515 1),非皮损区及健康对照皮肤中MBL表达弱或几乎无表达(分别为0.416 3±0.160 1和0.381 6±0.310 9),银屑病皮损区较非皮损区和健康对照皮肤显著升高(t值分别为2.24和2.32,均P＜0.05),非皮损区与健康对照皮肤MBL表达水平间比较差异无统计学意义(t=1.51,P＞0.05)。Western印迹检测结果显示,银屑病皮损区、非皮损区及健康对照皮肤中均有MBL蛋白表达,相对表达量分别为0.273 1±0.129 4、0.186 3±0.193 1、0.149 2±0.268 7,银屑病皮损区较非皮损区及健康对照皮肤显著增高(t值分别为2.05和2.28,均P＜0.05),非皮损区与健康对照皮肤表达差异无统计学意义(P＞0.05)。结论银屑病患者皮损区MBL蛋白高表达,可能与银屑病的发病存在一定关系。

银屑病;甘露糖结合凝集素类;免疫,天然

天然免疫紊乱在银屑病发病过程中发挥重要作用[1-3]。甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)作为天然免疫防御系统的重要组成部分,在机体天然免疫防御和免疫复合物清除中发挥作用。本研究拟通过免疫组化和蛋白印迹法观察寻常性银屑病患者皮损、非皮损和健康对照皮肤组织中MBL的表达情况,初步探讨MBL与银屑病发病可能存在的关系。

资料与方法

一、研究对象

进行期寻常性银屑病患者30例,男19例,女11例;年龄13～63岁,平均36.7岁,病程0.3～10年。取皮肤标本前2周内未外用糖皮质激素,3个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂、激光治疗及光化学疗法。标本取自银屑病皮损和皮损周围外观正常皮肤。30例健康对照皮肤来自本院美容整形科手术患者,男18例,女12例;年龄16～61岁,平均年龄33.6岁。银屑病患者组和健康对照组性别、年龄差异均无统计学意义。本研究通过医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。

二、主要试剂

MBL单克隆抗体(丹麦Antibodyshop公司生产),抗β肌动蛋白抗体(上海碧云天生物有限公司),凯基全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),免疫组化SABC试剂盒(北京康煜辉生物技术有限公司)。P0012S型(Bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒、增强化学发光试剂盒(ECL试剂盒,美国Santa Cruz公司)。

三、实验方法

1.免疫组化检测:取银屑病患者皮损、非皮损及健康对照皮肤进行MBL免疫组化检测。切片组织行热抗原修复;10%山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育20 min;滴加一抗(MBL稀释滴度1∶500)工作液,4℃过夜;滴加生物素标记二抗,37℃孵育20 min;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素,37℃孵育15 min;二氨基联苯(DAB)显色;后经苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。应用ImagePro Plus6软件测定免疫组化染色区域吸光度(A值)进行半定量分析。

2.Western印迹分析:取-80℃保存的组织块100 mg,采用凯基全蛋白提取试剂盒进行蛋白抽提,BCA法测定蛋白质浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素薄膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜后加入一抗(1∶2 000 MBL抗体、1∶500 β肌动蛋白抗体),4℃过夜,PBS洗膜。然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠二抗(1∶1 250)反应液,室温下振荡反应。应用ECL试剂盒显影、定影,凝胶成像系统中成像。用TotalLab1.0软件进行各条带相对吸光度值的半定量分析,以各目的条带与β肌动蛋白的积分吸光度值(IOD)的比值代表其蛋白的相对表达量。

四、统计学处理

结 果

一、免疫组化检测银屑病患者皮损、非皮损及健康对照皮肤MBL的表达

银屑病患者皮损、非皮损及健康对照皮肤均见MBL表达,其相对表达量分别为0.636 7±0.515 1、0.416 3±0.160 1、0.381 6±0.310 9,银屑病患者皮损部MBL表达水平较非皮损区和健康对照皮肤显著升高(t值分别为2.24和2.32,均P＜0.05),非皮损区与健康对照皮肤MBL表达水平间差异无统计学意义(t=1.51,P＞0.05)。见图1。

图1 甘露糖结合凝集素(MBL)在银屑病皮损区及非皮损区的免疫组化染色(免疫组化×400) 1a:银屑病非皮损区MBL表达在棘细胞层及基底层,表达较弱;1b:银屑病皮损区MBL表达主要在基底层,表达强阳性;1c:健康对照皮肤几乎无阳性表达

图2 甘露糖结合凝集素(MBL)蛋白在银屑病皮损区及非皮损区皮肤中的表达 1:银屑病非皮损;2:银屑病皮损;3:健康对照皮肤

二、Western印迹检测银屑病患者皮损、非皮损及健康对照皮肤MBL的表达

银屑病患者皮损、非皮损及健康对照皮肤均有MBL表达,其MBL蛋白相对表达量分别为0.273 1±0.129 4、0.186 3 ± 0.193 1、0.149 2± 0.268 7, 银屑病患者皮损部位MBL表达水平较非皮损区及健康对照皮肤显著升高(t值分别为2.05和2.28,均P＜0.05)。非皮损区与健康对照皮肤MBL表达水平间差异无统计学意义(t=0.61,P＞0.05)。见图2。

讨 论

银屑病患者体内存在天然免疫紊乱现象,选择天然免疫系统中的细胞和分子成分作为靶点已成为治疗银屑病的重要手段和研究方向[4-5]。针对部分天然免疫相关因子白细胞介素12/23、肿瘤坏死因子α治疗银屑病已进入Ⅱ期临床研究及临床应用阶段,并取得令人满意的治疗效果[4-6],提示天然免疫在银屑病的发病过程中可能起着非常关键的作用。

人类甘露糖结合凝集素是天然免疫防御系统中的重要组成部分,为非酶非抗体的天然一线抗感染免疫分子,是一种钙离子依赖性糖结合蛋白,在肝脏合成后分泌到血液中。在抗原抗体发生特异性免疫反应之前，诱导激活机体的非特异性免疫反应,现已证实MBL至少有以下4种功能:激活补体、促进调理吞噬、调节炎症反应及促进凋亡[7-8]。如果MBL发生基因突变,导致缺损或异常,则影响机体的天然免疫能力。多项研究表明,MBL基因突变和由此引起的MBL血清水平的变化与感染性疾病、自身免疫性疾病的发生有显著相关关系[9-12]。有学者研究MBL与系统性红斑狼疮的关系,结果显示,MBL2基因多态性和低MBL血清水平与系统性红斑狼疮的发生及临床症状的严重程度显著相关[12-13]。Tao等[10]对151例呼吸道感染患儿MBL结构基因启动子区的基因多态性、血清MBL水平与感染的关系进行研究,发现患儿血清MBL浓度明显低于健康组,其等位基因变异频率显著高于健康组,且基因变异与血清MBL浓度间存在一定相关关系。2003年Jensenius等[14]首次合成了重组MBL,为开展药物临床实验提供了条件。重组MBL对于感染性疾病、乳腺癌等患者的Ⅱ期临床实验已取得较为满意的临床疗效[15-17]。

我们的前期研究结果显示,银屑病组MBL突变基因型频率显著高于健康对照组,银屑病组GAC等位基因频率增高,而银屑病患者血清MBL水平显著低于对照组[18]。本文进一步对银屑病患者皮损中MBL表达的情况进行免疫组化及Western印迹检测,结果表明,银屑病皮损区MBL水平较非皮损区及健康对照皮肤显著增高。因而推测银屑病患者血清MBL水平降低除受MBL基因多态性的影响外,还可能与皮损区MBL沉积等代谢消耗有关,亦或可能有其他机制存在。我们推测,银屑病皮损区的MBL可能通过激活补体等方式,介导炎症介质对局部皮肤造成损伤。

Turan等[19]对50例银屑病患者MBL基因第54号密码子基因多态性进行研究,结果显示,银屑病患者MBL突变基因型GGC/GAC频率显著高于健康对照组,但对银屑病皮损中MBL的表达未做探讨。MBL与银屑病发病的关系有待进一步研究。

[1]Gaspari AA.Innate and adaptive immunity and the pathophysiology of psoriasis[J].J Am Acad Dermatol，2006，54(3 Suppl 2):S67-S80.

[2]Curry JL，Qin JZ，Bonish B，et al.Innate immune-related receptors in normal and psoriatic skin[J].Arch Pathol Lab Med，2003，127(2):178-186.

[3]Killeen ME，Ferris L，Kupetsky EA，et al.Signaling through purinergic receptors for ATP induces human cutaneous innate and adaptive Th17 responses:implications in the pathogenesis of psoriasis[J].J Immunol，2013，190(8):4324-4336.

[4]Guerra I，Gisbert JP.Onset of psoriasis in patients with inflammatory bowel disease treated with anti-TNF agents[J].Expert Rev Gastroenterol Hepatol，2013，7(1):41-48.

[5]Mease P.Update on treatment of psoriatic arthritis[J].Bull NYU Hosp Jt Dis，2012，70(3):167-171.

[6]Laws PM，Young HS.Current and emerging systemic treatment strategies for psoriasis[J].Drugs，2012，72(14):1867-1880.

[7]Presanis JS，Kojima M，Sim RB.Biochemistry and genetics of mannan-binding lectin(MBL)[J].Biochem Soc Trans，2003，31(Pt 4):748-752.

[8]Turner MW.The role of mannose-binding lectin in health and disease[J].Mol Immunol，2003，40(7):423-429.

[9]Harrison E，Singh A，Morris J，et al.Mannose-binding lectin genotype and serum levels in patients with chronic and allergic pulmonary aspergillosis[J].Int J Immunogenet，2012，39(3):224-232.

[10]Tao R，Hua CZ，Hu YZ，et al.Genetic polymorphisms and serum levels of mannose-binding lectin in Chinese pediatric patients with common infectious diseases[J].Int J Infect Dis，2012，16(5):403-407.

[11]Xu WD，Peng H，Zhou M，et al.Association of RANTES and MBL gene polymorphisms with systemic lupus erythematosus:a meta-analysis[J].Mol Biol Rep，2013，40(2):941-948.

[12]Panda AK，Parida JR，Tripathy R，et al.Low producer MBL genotypes are associated with susceptibility to systemic lupus erythematosus in Odisha，India[J].Hum Immunol，2013，74(1):114-119.

[13]Hristova M，Dourmishev L，Kamenarska Z，et al.MBL2 polymorphisms-manifestations in Bulgarian Bulgaria pat adult dermatomyositis and systemic lupus erythematosus[J].Int J Immunogenet，2014，41(2):119-125.

[14]Jensenius JC，Jensen PH，McGuire K，et al.Recombinant mannanbinding lectin(MBL)for therapy[J].Biochem Soc Trans，2003，31(Pt 4):763-767.

[15]Gupta K，Gupta RK，Hajela K.Disease associations of mannosebinding lectin&potential of replacement therapy[J].Indian J Med Res，2008，127(5):431-440.

[16]Maaløe N，Bonde C，Laursen I，et al.Mannan-binding lectin and healing of a radiation-induced chronic ulcer:a case report on mannan-binding lectin replacement therapy[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg，2011，64(6):e146-e148.

[17]Chalmers JD，Fleming GB，Hill AT，et al.Impact of mannosebinding lectin insufficiency on the course of cystic fibrosis:A review and meta-analysis[J].Glycobiology，2011，21(3):271-282.

[18]苏英，郭淑兰，于晓静，等.银屑病患者甘露糖结合凝集素基因多态性及血清水平的研究[J].中华皮肤科杂志，2014，47(3):157-159.

[19]Turan H，Karkucak M，Yakut T，et al.Does MBL2 codon 54 polymorphism play a role in the pathogenesis of psoriasis?[J].Int J Dermatol，2014，53(1):34-38.

2014-03-19)

(本文编辑:颜艳)

Expression of mannose-binding lectin in lesions of psoriasis vulgaris

Su Ying，Guo Shulan，Yu Xiaojing，Li Chunyang，Sun Qing.Department of Dermatology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China

Sun Qing，Email:sywxlwjz@163.com

ObjectiveTo investigate the expression of mannose-binding lectin(MBL)in lesions of patients with psoriasis vulgaris，and to explore the relationship between MBL and psoriasis pathogenesis.MethodsImmunohistochemistry and Western blot were performed to detect the expression of MBL in lesional and normalappearing perilesional skin of 30 patients with progressive psoriasis vulgaris，as well as in normal skin of 30 healthy human controls.Statistical analysis was carried out byttest using SPSS13.0 software.ResultsImmunohistochemistry showed that MBL was expressed in lesional psoriatic skin，but weakly expressed or absent in normalappearing perilesional skin and normal control skin，with the relative expression level of MBL in lesional skin significantly higher than that in perilesional skin and normal control skin(0.636 7±0.515 1 vs.0.416 3±0.160 1 and 0.381 6 ± 0.310 9，t=2.24，2.32，respectively，bothP＜ 0.05).Western blot revealed a positive expression of MBL protein in all the skin specimens，and the expression intensity of MBL protein in lesional psoriatic skin was significantly increased compared with perilesional psoriatic skin and normal control skin(0.273 1±0.129 4 vs.0.186 3 ± 0.193 1 and 0.149 2 ± 0.268 7，t=2.05，2.28，respectively，bothP＜ 0.05).No significant difference was shown in the expression of MBL protein between perilesional psoriatic skin and normal control skin by immunohistochemistry(t=1.51，P＞ 0.05)or Western blot(t=0.61，P＞ 0.05).ConclusionThere is a high expression of MBL protein in lesions of patients with psoriasis vulgaris，which may be somewhat associated with the pathogenesis of psoriasis.

Psoriasis;Mannose-binding lectins;Immunity，natural

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.001

国家自然科学基金青年基金(30901295);山东省自然科学基金(Y2007C033)

250012济南，山东大学齐鲁医院皮肤科

孙青,Email:sywxlwjz@163.com