卡介菌多糖核酸对尖锐湿疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的影响

王振华 杨芳红 孙怡 王辉 薛峰

卡介菌多糖核酸对尖锐湿疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的影响

王振华 杨芳红 孙怡 王辉 薛峰

目的探讨卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)对尖锐湿疣(CA)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)的影响。方法42例首次发病的CA患者分成联合治疗组(26例)和电灼组(16例)，联合治疗组给予电灼后肌内注射BCG-PSN 0.35 mg隔日1次连续3个月，电灼组只进行电灼治疗，在初诊时和3个月后分别进行Treg细胞的检测，观察疗效及Treg细胞水平的变化。另有健康体检者30例作为健康对照组。结果CA患者外周血Treg细胞水平明显高于健康对照组(8.31%±1.24%比5.15%±0.72%，P＜0.01)，其中复发组较未复发组高(9.34%±0.72%比7.45%±0.85%，P＜0.01)；联合治疗组复发率明显低于电灼组(30.77%比68.75%，P＜0.05)，3个月后Treg细胞水平下降，明显低于电灼组(5.87%±1.05%比6.60%±0.75%，P＜0.05)。结论Treg细胞比值的高低与CA患者疾病的转归有密切的关系，比值越高越容易复发。BCG-PSN可通过降低Treg细胞的数量来调节CA患者的抗病毒免疫应答，改善其预后。

尖锐湿疣；卡介菌多糖核酸；CD4-阳性T淋巴细胞；FoxP3

尖锐湿疣(condyloma acuminata，CA)是人乳头瘤病毒(HPV)感染导致的复发率较高的性传播性疾病，其发病、复发与机体的免疫功能有密切关系。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)是受关注的免疫细胞，有研究证实，Treg细胞与CA的发病有密切相关性[1-2]。卡介菌多糖核酸(BCGPSN)是从卡介菌中提取的一种具有免疫调节功能的物质，在CA的治疗中发挥着一定的作用。为进一步探讨Treg细胞与CA的关系以及BCG-PSN对CA患者外周血Treg细胞的影响，我们应用BCG-PSN联合电灼治疗CA并观察了治疗前后Treg细胞水平的变化，报告如下。

一、对象和方法

(一)对象:2012年10月至2013年9月来我科门诊就诊的首次发病CA患者42例，其中男30例，女12例；年龄19～52岁，平均(31.02±8.37)岁；病程(21.71± 9.69)d，皮损0.3～3 cm，数目4～35个，平均(15.83±7.41)个。 所有入选病例均具有典型的临床表现，皮疹醋酸白试验阳性，有非婚性接触史。排除标准:有自身免疫性疾病、恶性肿瘤、合并其他性病或者感染性疾病、严重肝肾功能不全、妊娠、近半年内应用糖皮质激素等免疫抑制剂或者免疫调节剂者。另外选取我院体检中心健康体检者30例作为健康对照组。两组的年龄、性别经统计学分析差异无统计学意义，具有可比性(P＞0.05)。

(二)方法:

1.试剂与仪器:荧光标记单克隆抗体CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE 及同型对照小鼠 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、荧光标准微球及破膜固定液均为美国BD公司产品。淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物医学工程研究所。流式细胞仪FACSCalibur为美国BD公司生产。

2.实验方法:抽取静脉血4 ml，肝素抗凝。Ficoll密度梯度离心法用淋巴细胞分离液常规分离单一核细胞，调整细胞数为10×106/ml，取两支试管，分别加入100 μl细胞悬液(1×106)，分为同型对照管和检测管。同型对照管加小鼠IgG1-FITC及 IgG1-APC 10 μl， 检测管加 CD4-FITC及CD25-APC 10 μl荧光标记单抗，室温避光孵育30 min；PBS洗涤后，固定破膜，然后同型对照管加IgG1-PE、检测管加Foxp3-PE抗体各10 μl，室温避光孵育30 min。PBS洗涤后，重悬细胞，上机测定。Treg细胞以CD4+CD25+Foxp3+T细胞/CD4+T细胞比值表示。

3.治疗方法:将CA患者分为两组，完成随访者42例，其中联合治疗组26例，电灼组16例。联合治疗组在常规消毒后局部浸润麻醉，外涂5%醋酸以显示亚临床病灶，之后应用GX-Ⅲ型多功能电离子治疗机(广西科学院应用物理研究所)对皮损进行电灼祛除，之后应用BCG-PSN(商品名迪苏，浙江万马药业有限公司)肌内注射，隔日0.35 mg，连续3个月，电灼组只进行电灼祛除皮损。两组患者随访时若发现CA复发则继续给予电灼治疗。为保证可比性，所有电灼治疗操作由同一组医护人员完成。

所有CA患者初次就诊时详细记录其皮损的部位、数量、病程并检测Treg细胞比值，以后每半个月随访1次，连续3个月，观察疗效及不良反应。随访结束再检测1次Treg细胞比值。祛除皮损后连续3个月不复发判为痊愈，3个月随访期间皮损又出现则判为复发。

4.统计学处理:应用SPSS19.0软件进行统计学处理，两样本均数比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.CA患者Treg细胞占CD4+T细胞的百分比较健康对照组者显著升高，差异有统计学意义，见表1。联合治疗组26例CA患者在随访期间复发8例，复发率30.77%，而电灼组16例中复发11例，复发率68.75%，二者相比差异有统计学意义，χ2=5.77，P＜ 0.05。 见表1。

2.联合治疗组和电灼组在初次就诊时Treg细胞占CD4+T细胞的百分比差异无统计学意义；3个月随访结束该数值在两组中都较初次就诊时下降(均P＜0.01)，但是联合治疗组下降更为明显，二者相比差异有统计学意义，见表2。

3.不良反应:联合治疗组和电灼组均未出现不良反应。

三、讨论

Treg细胞能够通过抑制抑制CD4+和CD8+细胞的IL-2基因的转录和表达来抑制T细胞的活化和增殖，并能控制由树突细胞诱导的Th1和Th2的分化，从反向调节机体抗病毒免疫应答的强弱程度，影响细胞介导的免疫保护作用，并形成持续感染[1，3]。我们研究发现，CA患者外周血Treg细胞占CD4+T细胞的百分比较健康对照组者显著升高，其中复发组又较未复发组高，这与以往的研究结果一致[1，4]，提示CA患者体内存在明显的免疫抑制状态，而Treg细胞比值的高低与CA患者疾病的转归又有密切的关系，比值越高越容易复发。

表1 尖锐湿疣患者和健康对照组外周血Treg细胞占CD4+T细胞的比值(±s)

表1 尖锐湿疣患者和健康对照组外周血Treg细胞占CD4+T细胞的比值(±s)

注:a:与健康对照组比较，P＜0.01；b:与未复发组比较，P＜0.01

组别 例数 Treg细胞比值(%)尖锐湿疣组 42 8.31±1.24a复发组 19 9.34±0.72b未复发组 23 7.45±0.85健康对照组 30 5.15±0.72

表2 联合治疗组和电灼组外周血Treg细胞占CD4+T细胞治疗前后的比值(%，±s)

表2 联合治疗组和电灼组外周血Treg细胞占CD4+T细胞治疗前后的比值(%，±s)

注:a:治疗前后比较，均P＜0.01

组别 例数 初诊时Treg细胞比值随访结束时Treg细胞比值(%)联合治疗组 26 8.03±1.19 5.87±1.05a电灼组 16 8.76±1.21 6.60±0.75a t值 1.916 2.390 P值 ＞0.05 ＜0.05

有学者观察到，BCG-PSN能使CA患者外周血CD4+/CD8+比值和IL-2水平升高，使CD8+百分率和可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)水平降低，提示BCG-PSN对CA患者的免疫功能有良好的调节作用[5]。我们研究发现，联合治疗组CA患者应用BCG-PSN3个月后，其复发率明显低于电灼组，而且其外周血Treg细胞占CD4+T细胞的百分率明显下降，低于原本差异无统计学意义的电灼组CA患者的相关数值，提示BCG-PSN能逆转CA患者的免疫抑制，能通过降低Treg细胞的数量来正向调节CA患者的抗病毒免疫应答，改善CA疾病的预后和转归。至于具体机制，尚待进一步研究。

[1]钱起丰，卢创林，张明霞.CA患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的检测[J].中华皮肤科杂志，2008，41(5)：311-313.

[2]刘慧贤，王振华.CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞与HPV感染的相关性[J].中国麻风皮肤病杂志，2013，29(5)：328-330.

[3]Sakaguchi S，Yamaguchi T，Nomura T，et al.Regulatory T cells and immune tolerance[J].Cell，2008，133(5)：775-787.

[4]Cao Y，Zhao J，Lei Z，et al.Local accumulation of FOXP3+regulatory T cells：evidence for an immune evasion mechanism in patients with large condylomata acuminata[J].J Immunol，2008，180(11)：7681-7686.

[5]肖嵘，李干群，张桂英，等.卡介菌多糖核酸对尖锐湿疣患者的免疫调节作用及临床疗效[J].中华皮肤科杂志，2001，34(3)：214.

2014-02-26)

(本文编辑:吴晓初)

Effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin on CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in peripheral blood of patients with condyloma acuminatum

Wang Zhenhua，Yang Fanghong，Sun Yi，Wang Hui，Xue Feng.Department of Dermatology，Weifang People's Hospital，Weifang 261041，Shandong，China

Wang Zhenhua，Email：wfzcwzh@126.com

ObjectiveTo evaluate the effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin(BCG-PSN)on peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+regulatory T(Treg)cells in patients with condyloma acuminatum(CA).MethodsForty-two patients with first onset of CA were randomly assigned to receive either injection of BCG-PSN(0.35 mg every other day for 3 months)after fulguration(combination group，26 patients)，or fulguration only(fulguration group，16 patients).Venous blood samples were obtained from all the patients at the initial visit and three months after the beginning of treatment，as well as from 30 healthy checkup examinees.The percentage of peripheral Treg cells in CD4+T lymphocytes was determined by flow cytometry.The recurrence of CA was evaluated during the three months after the beginning of treatment.ResultsThe percentage of peripheral Treg cells in CD4+T lymphocytes was significantly higher in patients with CA than in the controls(8.31%±1.24%vs.5.15% ±0.72%，P＜0.01)，and in patients with clinical recurrence of CA than in those without(9.34% ±0.72%vs.7.45% ±0.85%，P＜0.01).The recurrence rate was significantly lower in the combination group than in the fulguration group(30.77%vs.68.75%，P＜ 0.05).After three months of treatment，the combination group showed lower percentage of Treg cells in CD4+T cells compared with the fulguration group(5.87%±1.05%vs.6.60%±0.75%，P＜0.05).Conclusions The percentage of Treg cells has a close relationship with the progression of CA，i.e.，the higher the percentage，the more frequent the relapse.BCG-PSN may enhance the antiviral immune response in patients with CA and improve their prognosis by reducing the number of Treg cells.

Condylomata acuminata；BCG-PSN；CD4-positive T-lymphocytes；FoxP3

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.018

261041山东，潍坊市人民医院皮肤科

王振华，Email:wfzcwzh@126.com