蛋白酶体抑制剂MG132减轻糖尿病大鼠肾小管间质纤维化

王圆圆，刘丽荣，李 霜，郭 兵，石 磊，石明隽，肖 瑛

在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发生发展过程中，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)激活其下游的 Smad2/3，导致其目的基因的转录活化，促进肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)向间质细胞转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成和过度沉积，造成广泛的肾组织纤维化［1－5］。Smad7 作为抑制性Smad蛋白，可抑制 TGF-β1/Smads信号通路致纤维化效应［1，6］。然而在 DN 进程中，Smad7蛋白的表达是显著下调的，其机制可能与Smad泛素化调节因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2，Smurf2)介导的泛素化降解有关［1，7］。蛋白酶体抑制剂 MG132能对抗糖尿病介导的肾损伤［8－10］，但其抑制肾小管-间质纤维化的机制尚不甚清楚。本研究旨在观察DM大鼠肾组织Smurf2、Smad7蛋白及纤维化相关指标的表达变化，并用MG132处理RTECs后高糖培养，观察对 Smad7和 Smurf2及EMT和ECM相关指标的影响，探讨MG132治疗肾小管-间质纤维化的机制，为MG132治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

链脲菌素(streptozotocin，STZ)和MG132(Sigma公司);胎牛血清(Gibco Introvagen公司)、低糖DMEM培养液(Hyclone公司);Rabbit-anti-SMAd7、Rabbit-anti-角 蛋 白 18(Cytokeratin-18，CK-18)、Mouse-anti-α-平滑肌肌动蛋白(α-sooth muscle actin，α-SMA)、Rabbit-anti-纤 连 蛋 白 (fibronectin，FN)和 Rabbit-anti-胶 原 蛋 白 Ⅰ(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)多克隆抗体(博奥森生物技术有限公司)，Mouse-anti-β-actin单克隆抗体和DAB显色剂(博士德生物技术有限公司)，Rabbit-anti-Smurf2(1∶600)(Abcam 公司)、Rabbit-anti-钙黏蛋白(E-cadherin)(Santa Cruz公司);两步法免疫组化检测试剂(中杉金桥生物技术有限公司);Western印迹用PVDF膜;Goat-anti-Rabbit FITC、Goat-anti-Mouse Tex-red、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI);超敏 ECL化学发光试剂盒(碧云天生物研究所);其他试剂均为市售分析纯;RERCs(NRK-52E细胞)由上海复旦大学陆利民教授惠赠。

1.2 方法

实验动物及糖尿病模型的制备:清洁级雄性SD大鼠20只，体质量(180±20)g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，批号:SCXK(京)2009-0004。适应性饲养1周后，乙醚麻醉后尾静脉按55 mg/kg注射0.01 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)的链脲菌素。48 h后测空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L为糖尿病组(DM)。并设同龄正常对照组(NC)，每组(n=10)。各组大鼠均给予普通饲料，自由饮水。实验24周时处死动物，处死前收集24 h尿液，记录尿量。禁食6～8 h，称重，麻醉后股动脉采集血液，4℃离心，分离血清，尿液和血清于－20℃保存供检测尿蛋白及生化指标用。开腹取胰腺和肾脏，胰腺及一侧肾脏固定于4%多聚甲醛，供制作石蜡切片用，另一肾脏于－80℃保存供Western blot印迹检测。

1.3 生化指标检测和组织形态学观察

采用氧化酶法测血清葡萄糖(BG);考马斯亮蓝法测尿蛋白(UP)，Bayer1650全自动生化分析仪检测。尿蛋白与尿量乘积为24 h尿蛋白量。胰腺及肾脏组织行石蜡切片，HE染色后光镜下观察胰腺形态结构的改变，HE、Masson染色观察肾组织的形态结构改变和纤维化病变。

1.4 细胞培养

将细胞分为1)正常糖对照组(NG):予以0.12‰的溶媒二甲基亚砜(DMSO)加入DMEM+2%胎牛血清培养3 h后，换DMEM+2%胎牛血清培养;2)高糖对照组(HG):予以 0.12‰ DMSO加入DMEM+2%胎牛血清培养3h后，换19.5 mmol/L D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培养;3)高糖MG132处理组:予于终浓度分别为1μmol/L MG132，2 μmol/L MG132，5 μmol/L MG132 加入DMEM+2%胎牛血清培养3h后，换19.5 mmol/L D-glucose+DMEM+2%胎牛血清培养;每组继续培养48 h。

1.5 免疫组化染色、免疫荧光染色和Western blot检测

用免疫组化两步法检测组织切片Smad7(1∶200)、Smurf2(1∶600)、E-cadherin(1∶100)、α-SMA(1∶100)、FN(1∶50)及 Col-Ⅰ(1∶150)在各组大鼠肾组织的分布和表达。FN、Col-Ⅰ阳性表达计数方法参考本实验室以前的研究［1］，计数10个高倍视野(400倍)，取均值。用免疫荧光间接染色法分别检测CK-18(1∶100)、FN(1∶100)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶100)在 NRK-52 细胞表达和分布，OLYMPUS-DP72倒置荧光显微镜观察并采集图像。

各组大鼠肾皮质及细胞加裂解液裂解，分别提取蛋白，经电泳转膜封闭后，特异性抗体孵育浓度如下:Smad7(1∶200)、Smurf2(1∶600)、E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶150)、Col-Ⅰ(1∶200)和β-actin(1∶400)，检测各目标蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

所有数据用SPSS13.0统计软件分析处理，以均数±标准差)表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，S-N-K法检验。

2 结果

2.1 大鼠一般情况和生化指标的变化

DM大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食等现象，体质量显著减轻(p＜0.05);而24 h尿蛋白(313.06±47.7 vs 39.22±10.31)mg及血糖(28.34±4.60)vs(7.13±1.26)mmol/L显著高于NC组(p＜0.05)。

2.2 糖尿病大鼠胰腺组织和肾组织病理学改变

NC组大鼠胰岛完整，轮廓规则整齐，胰岛内细胞排列整齐，胞质饱满，细胞界限清楚，DM组胰岛内形态欠规则，细胞排列紊乱，常有细胞缺失、塌陷及炎性细胞浸润(图1A)。

NC组肾脏结构清晰完整，肾小管上皮细胞饱满，DM组大鼠部分肾小管扩张，肾脏结构排列不清，可见肾小体和肾小管的纤维化明显，肾小管上皮细胞空泡变性，细胞萎缩和脱落，小管间质细胞增多伴有炎性细胞的浸润，间质区增宽，毛细血管基底膜增厚(图1B)。

2.3 糖尿病大鼠肾组织 E-cadherin、α-SMA及FN、Col-Ⅰ分布和表达

E-cadherin在大鼠肾组织主要表达于肾小管上皮细胞，在正常大鼠的肾皮质表达较高，而DM大鼠表达减少;相反，α-SMA正常大鼠的肾皮质表达极少，而在DM组大鼠肾小管上皮细胞可见到大量阳性染色。与NC组相比，DM组大鼠肾皮质中E-cadherin蛋白的表达明显下调(p＜0.05)，α-SMA蛋白的表达显著增多(p＜0.05)(图2)。

NC组大鼠肾组织 FN及Col-Ⅰ的阳性染色仅少量存在于细胞间质;DM组大鼠肾组织FN和Col-Ⅰ的表达明显增加(p＜0.05)，肾小管间质尤为明显(图3)。

图1 各组大鼠胰腺和肾组织形态学变化Fig 1 Histological change of pancreas and kidneys in each group rats(×200)

2.4 Smad7及Smurf2蛋白在各组大鼠肾组织中的表达

Smad7及Smurf2在大鼠肾组织主要分布于肾小管上皮细胞，与NC组相比，DM组大鼠肾皮质中Smad7蛋白的表达明显下调(p＜0.05)，而Smurf2在DM组大鼠肾组织表达显著增加(p＜0.05)(图4)。

2.5 NRK-52E细胞鉴定

NRK-52E细胞高表达E-cadherin和CK-18蛋白，几乎看不到α-SMA蛋白阳性染色表达，说明培养细胞纯度良好(图5)。

图4 Smad7及Smurf2蛋白在各组大鼠肾组织中的表达Fig 4 Expressions of Smad7 and Smurf2 in kidney tissue in each group，n=10)

图5 E-cadherin、α-SMA及CK-18在NRK-52E细胞的表达Fig 5 Immunofluorescencel staining of E-cadherin，α-SMA and CK-18 in NRK-52E cells(×200)

2.6 不同环境下NRK-52E细胞E-cadherin、α-SMA及FN的表达

NRK-52E细胞在正常糖环境培养下，E-cadherin表达较多，而α-SMA表达极少;相反，在高糖环境培养48 h后，E-cadherin表达明显减少，而α-SMA表达增多(图6A)。高糖培养NRK-52E细胞后，FN蛋白明显增多，主要沉积于细胞间质(图6B)。

2.7 MG132对高糖培养NRK-52E细胞E-cadherin，α-SMA及Col-Ⅰ表达的影响

高糖显著上调 NRK-52E细胞中 α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表达(p＜0.05)，下调 E-cadherin蛋白表达(p＜0.05);随MG132浓度的增高，高糖环境下NRK-52E细胞α-SMA和Col-Ⅰ蛋白表达减少(p＜0.05)，而E-cadherin蛋白表达增多(p＜0.05)(图7)。

2.8 MG132对 NRK-52E细胞 Smad7、Smurf2蛋白表达的影响

高糖环境下NRK-52E细胞中Smad7蛋白表达减少，而Smurf2蛋白的表达增多;MG132预处理浓度的增高，Smad7蛋白表达较单一高糖处理组逐渐增多(p＜0.05)，但Smurf2蛋白的表达与单一高糖处理组相比无明显差异(图8)。

图6 不同环境下E-cadherin、α-SMA及FN在NRK-52E细胞的表达Fig 6 Immunofluorescencel staining of E-cadherin，α-SMA，FN in NRK-52E cells after incubated in the different conditions(×200)

图7 MG132对高糖培养NRK-52E细胞E-cadherin，α-SMA及Col-Ⅰ表达的影响Fig 7 Effects of MG132 on the expressions of E-cadherin，α-SMA and Col-Ⅰ in NRK-52E cells after incubated in the different conditions(，n=3)

图8 MG132对NRK-52E细胞Smad7及Smurf2蛋白表达的影响Fig 8 Effects of MG132 on the protein expressions of Smad7 and Smurf2 in NRK-52E cells after incubated in the different conditions( s，n=3)

3 讨论

DM大鼠24周时，尿蛋白持续高浓度，肾组织纤维化病变严重，E-cadherin显著减少，而α-SMA高表达，提示RTECs EMT的发生，且FN及Col-Ⅰ在肾间质也显著增加，表明ECM的沉积增多。体外高糖培养NRK-52E细胞 48 h后，E-cadherin显著减少，而α-SMA高表达;FN和Col-Ⅰ表达也明显增多。故在高糖的持续刺激下，RTECs发生EMT且大量合成和分泌ECM，导致肾脏结构和功能的紊乱。

研究表明，TGF-β1/Smads通路在肾小管-间质纤维化发挥着多种致纤维化效应:参与RTECsEMT过程、促进间质 ECM 合成、介导 RTECs 的损伤［1－3，6］。而Smad7蛋白可与TβRI形成一个稳定复合物，并抑制其招募和磷酸化R-SMAd以及R-SMAd-SMAd4复合物的形成［11］，从而负调控TGF-β1/Smads 通路的传导。有报道在肾纤维化病程时，活化TGF-β1/Smads通路可诱导Smad7基因的表达［7］，但Smad7蛋白的表达却是减少的，这可能是由于TGF-β1介导E3泛素连接酶Smurf2特异性的识别Smad7将其泛素化后被蛋白酶体降解所致［1，7］。本研究提示:较正常对照组，在DM大鼠肾组织Smurf2高表达而Smad7蛋白表达下调，与体外高糖处理RTECs结果一致。有作者在UUO模型、5/6肾切除大鼠模型发现类似结果［2－3］。因此DN时Smurf2表达增加，促进了Smad7的泛素化途径的降解，导致TGF-β1/Smads信号通路失去控制，纤维化效应级联放大。相反，上调或过表达Smad7基因的DM大鼠可以减轻糖尿病导致的肾纤维化［1，6］。所以，恢复内源性Smad7蛋白表达成为防治DN的研究重点。

蛋白酶体抑制剂MG132能对抗糖尿病引起多种机制介导的肾损伤［9］。MG132属于醛基肽类化合物，该类化合物通过结构中的醛基和蛋白酶复合体催化中心20S的β1和β2苏氨酸残基的-OH结合，可逆性的抑制蛋白酶复合体的活性，进而抑制蛋白的降解［12］。本研究予于MG132干预NRK-52E细胞后高糖培养，致Smad7表达上调，EMT过程和ECM沉积受到抑制，而且这种效应呈现出量效依赖性，但Smurf2蛋白表达并未发生改变。提示MG132上调Smad7蛋白表达不是通过减少起识别作用的Smurf2表达，而是抑制蛋白酶体对靶蛋白的降解作用所致。从而可恢复Smad7蛋白表达，抑制EMT的发生和ECM的合成，减轻了肾小管-间质纤维化的发展，这可能是MG132治疗DN的机制之一。

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