RNA干扰YAP基因对人膀胱癌T24细胞株增殖和迁移能力的影响

胡光辉 徐亮 赖鹏 郭锥锋 刘欢 刘敏 王云 姚旭东 许云飞

上海市第十人民医院泌尿外科，同济大学附属第十人民医院，上海 200072

膀胱癌是泌尿系统中发病率最高的肿瘤，居于第1位。在男性所患肿瘤中居于第4位，致死性肿瘤中居于第9位，男女发病率比例为3∶1［1］。每年有超过330 000例新确诊膀胱肿瘤，超过130 000人死于膀胱癌。70%～80%的患者确诊时为非肌层浸润性膀胱癌，50%～70%会复发，10%～30%会进展为肌层浸润性膀胱 癌［2］。YAP是Hippo信号通路下游转录因 子［3］，目前研究认为YAP基因可能是致癌基因，在许多肿瘤中高表达［4-5］。YAP基因在膀胱癌中高表达并且与肿瘤分期、分级及预后显著相关［6］。本实验通过siRNA特异性下调YAP基因，观察YAP基因表达下调后对膀胱癌T24细胞增殖、迁移功能的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

人类膀胱癌T24细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用含 100 IU/mL青霉素、100 IU/mL链霉素(购自美国Hyclone公司)、10%胎牛血清(购自美国Hyclone公司)的RPMI-1640培养基(购自美国Hyclone公司)于CO2体积分数为5%的培养箱中培养。YAP抗体购自Cell Signaling Technology公司。YAP基因RNA干扰基因序列：靶向沉默YAP基因的RNA(siRNA)顺义链为：5’-GCAUCUUCFACAGUCUUCUTT’-3’；反义链为：5’-AGAAGACUGUCGAAGAUGCTT-3’。以siRNA NC的序列作为与人类基因组序列无任何匹配的阴性对照，siRNA NC顺义链为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反义链为：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及T24细胞转染

人膀胱癌T24细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-l640培养液中，以1×105个T24细胞每孔的密度将细胞分种于6孔培养板中，并置于 37 ℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度的温箱中培养，应用阳离子脂质载体LipofectamineTM2000将小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染入T24细胞，转染前细胞密度为70%～85%，siRNA转染终浓度为50 nmol/L，温育72 h。转染siRNA NC组作为阴性对照组，未做任何处理组细胞为空白对照组。

1.2.2 实时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测

总RNA提取试剂(TRIzol reagent)提取各实验组T24细胞的总RNA，紫外分光光度计准确定量。总RNA进行反转录获取cDNA后进行PCR反应。PCR反应条件为94 ℃变性；按下列参数循环32次：94 ℃变性20 s，57 ℃退火40 s， 72 ℃延伸40 s；最后72 ℃温育10 min。qRT-PCR引物YAP基因顺义链为：5’-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3’；反义链为：5’-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3’；β-actin基因顺义链为：5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’；反义链为：5’-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’。

1.2.3 蛋白质印迹法(Western blot)分析

细胞转染48～72 h后，收集细胞，利用RIPA细胞裂解液(购自北京康为世纪生物科技有限公司)提取总蛋白，二辛可酸(bicinchonininc acid，BCA)试剂盒(购自江苏碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度，并调整待测样本的蛋白质含量。每孔加50 μg的蛋白样品，电泳、转膜、封闭，按1∶1 000稀释一抗温育，置4 ℃冰箱过夜。TBST中洗膜3次，每次10 min，分别按 1∶2 000稀释二抗温育l h，TBST中洗膜3次，每次10 min。曝光、显影及定影，用底片扫描仪扫描X线胶片，通过Odyssey双色红外荧光成像系统(购自美国LICOR公司)读取目的电泳条带的密度值。

1.2.4 细胞增殖活性实验

取对数生长期T24细胞，按5 000个/孔接种于96孔板，每孔100 μL，每个样品设置5个复孔，边缘加100 μL PBS，在37 ℃、CO2体积分数为5%培养箱中培养。18 h后按LipofectamineTM2000说明书转染siRNA，siRNA转染终浓度为50 nmoL/L。转染后细胞培养12、24、36、48和72 h。每个检测时间点每孔加入10 μL细胞增殖活性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8，购自上海和元生物公司)。3～4 h后酶标仪检测450 nm的吸光度(A)值。

1.2.5 划痕试验

取对数生长期T24细胞，按1×105个/孔接种于6孔板，温育24 h后分别加入浓度为50 nmol含有空白对照或siControl或siRNA YAP的培养基，继续培养24 h后细胞已铺满6孔板，利用枪头尖在细胞培养液表面划一条痕迹(长约2 cm)，继续培养12和24 h后镜下观察各组T24细胞迁移变化情况。

1.2.6 Transwell迁移试验

采用Becton Dickinson公司的Transwell小室，消化6孔板中已转染的状态良好的T24细胞以1×105个/孔接种于6孔培养板内，温育16 h后分别加入浓度为50 nmol含有空白对照或NC control或siRNA的培养基24 h后消化离心，调整细胞密度为4×105/mL，取0.2 mL接种到Transwell小室，并将Transwell小室置于24孔板内，上室内为含1%灭活血清的培养基，下室为含10%灭活血清的培养基。培养20 h后用棉签头擦掉小室内细胞，予95%乙醇固定，0.1%结晶紫染色，洗净风干后于Leica荧光倒置显微镜200倍视野下拍照。33%冰醋酸洗脱结晶紫，检测A450nm值。实验重复3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 qRT-PCR及Western blot检测siRNA干扰后YAP基因及蛋白的表达

qRT-PCR和Western blot蛋白印迹杂交分析分别检测siRNA干扰YAP基因后在基因水平和蛋白水平的表达变化。结果显示：与空白对照组、NC组相比，siRNA处理组T24细胞的YAP基因的RNA(F=93.91，P＜0.000 1)、蛋白水平(F=4.62，P＜0.05)的表达量均被显著抑制 (图1、2)。

图1 qRT-PCR检测转染siRNA后T24膀胱癌中YAP mRNA表达量Fig. 1 Relative expression of YAP mRNA was detected by qRTPCR in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP

图2 Western blot检测转染siRNA后T24膀胱癌中YAP蛋白表达量Fig. 2 The expression of YAP protein was detected by Western blot in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP

2.2 siRNA降低YAP基因表达抑制T24细胞增殖活性

CCK-8法测定空白转染组、NC control组、siRNA组细胞不同时间的A值，随着细胞生长时间的延长，空白组与NC control组细胞生长能力无明显变化。而YAP-siRNA转染组T24细胞随着时间延长(12、24、36、48和72 h)和前2组比较细胞增殖减缓，差异有统计学意义 (12 h：F=6.00，P=0.037；24 h：F=41.72，P=0.000 3；36 h：F=462.8，P＜0.000 1； 48 h：F=236.6，P＜0.000 1；72 h：F=140.5，P＜0.000 1，图3)。因此，YAP基因调控膀胱癌细胞增殖。

2.3 siRNA降低YAP基因表达抑制T24细胞的迁移能力

Transwell迁移试验显示，在每高倍镜视野下，NC Control组和空白对照组的细胞数目显著高于siRNA YAP组(F=20.7，P<0.05，图4、5)。划痕试验显示，随时间的推移，空白对照组和NC control组细胞的愈合速度最快，而siRNA+YAP组的愈合速度最慢(F=43.55， P＜0.05)。因此，YAP可以显著增强膀胱癌T24细胞的迁移能力，而siRNA沉默YAP基因表达后可以有效地抑制YAP引起的T24细胞迁移能力的变化(图6、7)。

图3 CCK-8检测转染siRNA后T24膀胱癌细胞增殖活性Fig. 3 Cell proliferation was detected by CCK-8 assay in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP

图4 Transwell迁移实验检测转染siRNA后T24膀胱癌细胞迁移能力Fig. 4 Cell migration was detected in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP(×200)

图5 Tranwell 迁移实验A值检测分析Fig. 5 Analysis of cell migration

图6 划痕试验检测转染siRNA后T24膀胱癌的迁移能力Fig. 6 Wound healing was detected in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP(×100)

图7 划痕试验统计分析(0 h vs 24 h)Fig. 7 Analysis of wound healing (o h vs 24 h)

3 讨 论

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统最常见的肿瘤，并且术后极易复发，30%的患者确诊时已发生远处转移。膀胱尿路上皮癌复发的主要危险因素为肿瘤大小、多灶性、病理分期等［2］。而充分认识膀胱癌的生物学行为的分子机制具有重要作用。Hippo信号通路是近年来发现的重要的信号通路，主要通过细胞增殖和凋亡进行调控器官发育［4］，Hippo信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关［7-8］。YAP蛋白是Hippo信号通路下游重要的转录因子，通过磷酸化修饰发挥作用。YAP基因在许多肿瘤中过表达，如肝癌、结肠癌、肺癌等［9-11］。YAP基因在膀胱尿路上皮癌中表达上调，并且与膀胱癌患者T分期、淋巴转移以及预后密切相关。YAP蛋白免疫组化评分高的膀胱尿路上皮癌患者往往预后差、生存期短［6］。

YAP基因在泌尿系统肿瘤如膀胱癌、前列腺癌中均表达上调［12-13］，本实验首次通过siRNA在人膀胱癌T24细胞中下调YAP基因表达，RT-PCR以及Western blot分析结果显示，YAP基因在基因以及蛋白水平的表达均被抑制。通过RNA干扰技术，成功下调YAP基因表达后，发现膀胱癌T24细胞的增殖活性以及迁移能力被显著抑制。因此，YAP蛋白与膀胱癌的增殖、迁移、侵袭以及转移相关。在裸鼠体内移植瘤模型中，过表达YAP能显著促进肿瘤的生长［9］。过表达YAP基因能促进宫颈癌细胞上皮间质转化(epithelial–mesenchymal transition，EMT)［14］，EMT与肿瘤侵袭和转移密切相关，而在膀胱尿路上皮癌中，EMT信号通路处于活化状态［15］，并且活化程度在高级别和低级别膀胱癌中差异有统计学意义［16］。在肝癌细胞中，YAP上调Notch信号通路配体Jagged-1(Jag-1)激活Notch信号通路，调控肝癌细胞增殖、迁移以及侵袭［9］。YAP在膀胱癌中可能通过活化EMT以及激活Nocth信号通路或者其他通路促进膀胱癌复发、侵袭及转移。

易复发、转移是膀胱肿瘤的特点。肿瘤的增殖和转移是一系列多因素、多信号通路相互作用的结果。与siRNA干扰YAP在其他肿瘤细胞中观察到能明显抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭。YAP与Akt/PIK-TOR、Wnt、Notch通路等通路串话［9,14］，调控肿瘤细胞增殖、侵袭。YAP基因与膀胱尿路上皮癌分期、分级以及预后显著相关，并且调控膀胱尿路上皮癌细胞增殖、迁移。因此，关于YAP基因以及靶向YAP基因治疗膀胱肿瘤值得进一步研究。

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