α－苦瓜素体内抗人乳腺癌MCF－7移植瘤实验＊

沈富林，曹东亮，邓 斐，沈富兵△

1.湖北省十堰市郧县中医院（十堰 442500）；2.成都医学院 检验医学院（成都610500）

α－苦瓜素（α－momorchain，α－MMC）是从苦瓜籽中提取分离的一种核糖体失活蛋白（ribosomeinactivating proteins，RIPs），同天花粉蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白等I型RIPs一样，其能专一地水解真核细胞核糖体28SrRNA第A4324位上的腺嘌呤碱基与核糖之间的N－C糖苷键，释放出1个腺嘌呤碱基，阻遏延长因子EF－2与核糖体的结合，从而抑制蛋白质［1］。α－MMC具有广泛的生物学功能，包括抗肿瘤、抗病毒及细菌、抗生育、免疫调节等，其抗肿瘤作用受到广泛关注和研究。Tsao等［2］报道α－苦瓜素能选择性地杀伤绒毛膜癌细胞和黑色素瘤细胞，能较强抑制S－180实体瘤生长和NKM细胞的DNA、RNA 及其蛋白质合成活性［3］。Pan等［4］报道α－MMC在常氧和低氧情况下对人鼻咽癌细胞有选择性细胞毒性。笔者［5］前期研究发现，α－MMC对鼠乳腺癌细胞EMT－6具有较好的抗肿瘤活性，且体外实验［6］也显示出其对人乳腺癌细胞株（MDA－MB－231）具有明显抑制作用。目前α－MMC体外抗肿瘤作用研究较多，体内抗肿瘤作用研究较少，α－MMC体内抗人乳腺癌MCF－7移植瘤作用未见报道。本实验拟通过建立MCF－7裸鼠移植瘤模型探讨α－MMC的体内抗肿瘤效果，并通过检测肿瘤原位凋亡状况以了解α－MMC的抗肿瘤机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

α－MMC（溶剂为0.01MpH 7.4的 PBS缓冲液）由四川大学生命科学院孟延发教授惠赠，规格为2.5mg／mL，其制备方法见文献［7］。DMEM 培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司，青霉素－链霉素溶液购自美国Thermo公司，TUNEL原位检测试剂盒购自德国Roche公司。

1.2 实验动物

BALB／c裸小鼠（雌性，SPF级，18～20g）购于中国科学院上海实验动物中心。按SPF级动物饲养条件饲养，颗粒饲料、鼠笼、垫料、饲料及饮用水均经灭菌处理，鼠笼每周更换2次，动物房室内温度25℃，相对湿度70%，12h明暗交替，换气次数为10～20次／h，小鼠均自由饮水与摄食。

1.3 细胞培养

人乳腺癌MCF－7细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院，培养基为DMEM（含10%胎牛血清），37 ℃、5%CO2条件下培养。

1.4 人乳腺癌MCF－7移植瘤模型构建

常规培养人乳腺癌 MCF－7细胞株，以250mL的细胞培养瓶大量传代，获得所需细胞数后收获计数，以无血清DMEM培养基稀释成3×106个／mL，以1mL注射器接种至BALB／c裸小鼠腋下，0.2mL／只，观察肿瘤生长情况，并以游标卡尺测量肿瘤长径和短径。

1.5 α－MMC给药及抗肿瘤效果

当肿瘤体积达到80～100mm3时，裸鼠被随机分为4组，分别为α－MMC低、中、高3个剂量给药组和1个溶剂对照组，每组各8只。根据预实验结果，设定α－MMC低、中、高剂量分别为0.53、0.8、1.2mg／kg，给药方式为腹腔注射，3次／周；对照组腹腔注射0.2mL的PBS溶剂，4组均连续用药6周。用药期间观察裸鼠的一般情况，每周测量1次肿瘤大小。

肿瘤体积（TV）的计算公式为：TV＝1／2×a×b2，其中，a、b分别表示长宽。根据测量结果计算出“相对肿瘤体积”（RTV），RTV＝Vt／V0×100，其中V0为分笼给药当天测量所得肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为“相对肿瘤增殖率”［T／C（%）］，T／C（%）＝TRTV／CRTV×100，TRTV：治疗组 RTV；CRTV：阴性对照组 RTV。疗效评价标准：T／C（%）＞40%为无效；T／C（%）≤40%，并经方差分析与阴性对照组相比，P＜0.05为有效。

实验结束时麻醉条件下脱颈处死动物，剥取肿瘤块于10%甲醛溶液中固定，常规方法制作肿瘤组织切片，用TUNEL原位凋亡检测试剂盒测定肿瘤细胞的凋亡状况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，每组数据以均数±标准差（±s）表示，多组比较及组间比较应用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 α－MMC可明显抑制人乳腺癌 MCF－7移植瘤的生长

裸鼠MCF－7移植瘤模型实验中，对照组的肿瘤体积增长迅速，6周内增长了17倍，其平均终末RTV为（1 743.17±96.60）%。低剂量组平均终末RTV和T／C（%）分别为（1 203.89±79.05）%和69.06%，表现出一定的肿瘤生长抑制作用；而中、高剂量组肿瘤生长受到明显抑制，平均终末RTV分别为（680.37±33.26）%和（590.79±35.02）%，T／C（%）分别为39.03%和33.89%（表1、图1）。经统计分析，3个不同剂量给药组的RTV与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），但因低剂量组T／C（%）＞40%，被判定为差异无统计学意义，而中、高剂量组T／C（%）＜40%，判为差异有统计学意义，具有有效抑制作用。

表1 α－MMC体内抗肿瘤活性（±s，n＝8）

表1 α－MMC体内抗肿瘤活性（±s，n＝8）

剂量／（mg／kg）n MCF－7平均终末相对肿瘤体积／% 相对肿瘤增值率／%8 1 743.17±96.60 －α－MMC低剂量组（0.53mg／kg）8 1 203.89±79.05＊ 69.06 α－MMC中剂量组（0.8mg／kg）8 680.37±33.26＊ 39.03 α－MMC高剂量组（1.2mg／kg）8 590.79±35.02＊对照组（0mg／kg）33.89

图1 人乳腺癌MCF－7移植瘤相对肿瘤体积变化

2.2 α－MMC可诱导人乳腺癌 MCF－7移植瘤细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，α－MMC可诱导 MCF－7肿瘤组织细胞凋亡，3个不同剂量给药组（0.53、0.8、1.2mg／kg）α－MMC呈剂量依赖性荧光细胞数增多，而对照组未见凋亡荧光（图2）。

3 讨论

乳腺癌是一种常见女性恶性肿瘤，全世界每年超过138万人发病［8］，发病率日益增高。目前有研究［6］表明，苦瓜核糖体失活蛋白的α－MMC体外能抑制鼠乳腺癌EMT－6细胞株以及人乳腺癌细胞MDA－MB－231和 MCF－7的生长，体内实验［5］也观察到α－MMC对EMT－6和 MDA－MB－231移植瘤有较好抑制效果。同为Ⅰ型核糖体失活蛋白的天花粉蛋白（TCS）也观察到具有明显的抗乳腺癌作用［9］。因此，将苦瓜核糖体失活蛋白用于临床抗乳腺癌治疗具有较好的前景。

笔者通过BALB／c裸小鼠移植瘤模型观察α－MMC体内抗人乳腺癌MCF－7细胞株的效果，结果显示，3个不同剂量给药组的α－MMC都有明显的抗肿瘤效果，其RTV值与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），而中、高剂量组的抗肿瘤效果更好，符合相对肿瘤增值率＜40%有效性的判断标准。

图2 TUNEL染色法检测人乳腺癌MCF－7移植瘤细胞凋亡状况

RIPs的抗肿瘤机制主要是诱导肿瘤细胞凋亡，如有报道天花粉蛋白是通过线粒体和内质网应激压力信号通路诱导 HL－60细胞凋亡［10］，通过 PKC／MAPK／CREB信号途径来抑制 HeLa细胞的增殖［11］，通过下调Notch信号通路来抑制鼻咽癌细胞CNE2增殖［12］，并通过诱导鼻咽癌细胞 CNE1、CNE2凋亡及端粒酶活性来抑制鼻咽癌细胞的增殖［13］。体外培养的不同肿瘤细胞系用α－MMC及β－MMC作用后，结果显示α－MMC及β－MMC能显著增加Caspase 3和Caspase 9的活性及细胞色素C的释放。本研究观察到在中、高剂量组的肿瘤组织中经TUNEL染色有明显的细胞凋亡图像，证实了α－MMC是通过细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用的。

RIPs的药物毒性是困扰其临床应用的主要问题，笔者曾报道了α－MMC在SD大鼠体内可观察到较高的免疫原性、免疫毒性及肝毒性［14］，而用PEG修饰后能明显降低其毒性［15］。下一步课题组将在体内抗肿瘤药效的基础上研究其体内毒性，并通过系列剂量设置以获得α－MMC的治疗窗，为其临床抗乳腺癌实践提供安全性支撑。

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