牛脂联素与肌内脂肪沉积的关系初探

■丛立新 张国良 李 鹏 张连江 张 辉

(1.吉林农业科技学院动物科技学院，吉林省吉林市 132101；2.吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林省吉林市 132101)

肌内脂肪含量与肉质密切相关，优质牛肉肌内脂肪含量高，具有明显的大理石纹。肌内脂肪影响肉的嫩度、风味、肉色、系水力[1]。脂联素（adiponectin，ADPN）是脂肪细胞表达最丰富的细胞因子，大量存在于血液循环中。相关文献表明，ADPN是脂肪代谢的重要调控因子[2]。本课题组成员研究结果，ADPN水平和奶牛围产期的脂质代谢密切相关，脂联素有望成为调节肉牛肌内脂肪最有前途的候选基因。

通过观测延边黄年、草原红牛育肥的不同阶段主要肌肉块中肌内脂肪的含量、ADPN mRNA水平及其与肉牛肌肉大理石纹等级的关系，为探寻肉牛与肌内脂肪沉积相关的基因提供试验基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验设计与处理

各选择30头健康、体况相同、体重接近、18月龄左右的延边黄牛和草原红牛，分别随机分成3个重复组，每个小组均10头牛，供试肉牛单圈单槽饲喂。预试期10 d，精饲料日喂量逐渐增加到设定的营养水平后，进入正式肥育试验期，肥育时间6个月（前期4个月，后期2个月）。试验期间，分别于育肥的每月龄末采集脂肪样品（尾部），荧光定量RT-PCR法检测ADPN基因表达量（mRNA水平）。肥育期结束时从每个重复组中随机抽测3头肉牛屠宰。屠宰后采集眼肉等主要的肌肉样品，检测其脂肪的含量，评定大理石纹等级。

1.2 试验试剂

1.2.1 主要试剂与工具酶

Trizol试剂购自Gibco公司；琼脂糖（Promega）、酵母浸提物、Tris购自TaKaRa公司；焦磷酸二乙酯（DEPC）购自Sigm；乙醇、异丙醇、氯仿均为分析纯国产试剂；乙二胺四乙酸钠（EDTA）、十二基烷硫酸钠（SDS）、饱和酚等为长春Biotech公司产品；标准分子量DL-2000 Marker购自TaKaRa公司。反转录酶AMV Reverse Transcriptase为NEB公司产品；T4 DNA连接酶、RNasin为Promage公司产品，Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司生立，DH5α宿主菌为本实验室自制。

1.2.2 主要仪器设备

恒温空气浴振荡器（上海智城ZHWY-103D）；GeneQuant核酸浓度测定仪（英国pharmacia Biotech，Ltd公司）；不锈钢数显式鼓风干燥箱；紫外线透射反射仪WP型（永嘉上塘仪器厂）；脂肪测定仪（SZF-06A上海新嘉电子有限公司）；7930型高速冷冻立式离心机（日本KUBOTA公司）；PCR仪Tpersonal2000型(德国Biometra公司)、DY-Ⅲ型电泳仪（北京六一仪器厂）；恒温水浴箱（丹东市医疗器械厂生产）；ABI PRISM 7000型荧光定量PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.3 日粮营养水平与饲养管理

试验期间，同一肉牛品种同一育肥阶段喂饲相同的日粮，不同育肥阶段饲喂不同的日粮。粗饲料自由采食，以玉米秸杆为主。试验期间肉牛日粮组成及营养水平见表1。

1.4 采集肉样

分别于育肥的每月龄末，采集尾部脂肪样品300 mg，存于液氮中备用。于育肥的22月龄末、24月龄末肉牛屠宰时，以眼肉评定大理石纹等级，并采集胴体中主要肌肉块样品：眼肉、胸肉、上脑、腱子肉、腰肉各100 mg于-20℃保存，待测肌内脂肪含量。

1.5 检测指标

主要肌肉样脂肪含量，为肌肉干物质中脂肪所占百分比IMF(mg/g)，（索氏浸提法）。

脂肪样品中ADPN mRNA水平（荧光定量RTPCR法）。

肌肉大理石纹等级（中国优质牛肉等级标准）。

1.6 肌肉大理石纹等级的评定

肉牛大理石纹等级参照“优质牛肉系统评定方法和标准（96-003-04-12）”。对照大理石纹等级图片，确定眼肌横切面处大理石纹等级。大理石纹等级共分7个等级：1级、1.5级、2级、2.5级，3级、3.5级和4级。大理石纹极丰富为1级，丰富为2级，少量为3级，几乎没有为4级，介于两级之间为0.5级[3]。

1.7 脂肪组织中脂联素mRNA水平检测

Trizol两步法提取脂肪组织总RNA，操作步骤按说明书进行。琼脂糖凝胶电泳检查RNA条带的完整性，测定RNA纯度和浓度（DNA/RNA测量仪），将各样品RNA用DEPC水调至相同浓度，反转录，制备成cDNA。利用Primer Express 2.0设计软件，根据Genbank中ADPN序列，设计引物(上海基康生物工程公司合成)如表2。常规PCR。电泳后用凝胶试剂盒回收，连接到PMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，克隆后提取质粒，进行重组质粒的PCR和双酶切鉴定。将鉴定正确的阳性克隆送上海生工进行序列测定。

表1 延边黄牛、草原红牛育肥阶段日粮组成及营养水平

1.8 荧光定量RT-PCR方法

将测序正确的质粒经纯度及浓度测定后，用灭菌四馏水分别做梯度稀释，作为RT-PCR反应的阳性标准模板，每个水平设3个重复、3个阴性质控（NTC）。PCR体系（25 μl）：ddH2O 16.2 μl；dNTPs Mixture（2.5 mM）2.0 μl；10×Taq-buffer 2.5 μl；上、下游引物（12 pmol/μl）各 1.0 μl、探针（15 pmol/μl）1.0 μl；Ex Taq 酶（1 U/μl）0.3 μl；temperate DNA 1.0 μl。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，ABI PRISM 7000型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）中扩增50个循环。

表2 ADPN引物与探针

1.9 数据处理

统计学分析荧光定量测定的ADPN mRNA拷贝量，以平均值±标准差表示，用SPSS10.0软件进行分析，One-Way ANOVA（方差分析）组间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 肥育阶段肉牛肌内脂肪沉积量(见表3)。

表3 肥育末期不同品种肉牛优质切块肌内脂肪含量(%)

统计结果（见表3）显示，延边黄牛与草原红牛22月龄与24月龄眼肉、胸肉、腱子肉、腰肉、上脑肉肌内脂肪含量差异均显著(P＜0.05)，表明，随着育肥期的延长，延边黄牛与草原红牛肌内脂肪含量呈显著增加趋势。

2.2 延边黄牛和草原红牛不同肥育时期ADPN mRNA水平(见表4)

表4 各试验组ADPN mRNA水平

分析结果显示（见表4）：从19月龄到22月龄，延边黄牛脂肪组织中ADPN mRNA水平均随着育肥月龄的延长（除第一个月龄外）有增加的趋势(P＜0.05)，育肥期继续延长至24月龄，ADPN mRNA水平又极显著下降(P＜0.01)；草原红牛从19月龄到22月龄，其脂肪组织中ADPN mRNA水平均随着育肥期的延长而增加(P＜0.05)，育肥期继续延长至24月龄，ADPN mRNA水平极显著下降(P＜0.01)。

2.3 延边黄牛和草原红牛ADPN mRNA水平与肌肉大理石纹的关系

表5 肥育末期肉牛肌肉大理石纹等级

本试验结果（见表3）：24月龄末的延边黄牛和草原红牛眼肉脂肪含量均显著高于22月龄末(P＜0.05)；无论是延边黄牛还是草原红牛，24月龄时大理石纹均为3级，22月龄时肌肉大理石纹均为3.5级（见表5）。

3 讨论

近年来，研究者运用分子生物学方法对脂联素的生理功能的研究不断深入。脂联素mRNA在猪脂肪细胞中表达丰富[4]。Ding（2004）认为脂联素可能通过受体在猪的不同组织发挥生理作用。Sreenivasa等研究结果提示ADPN在鸡的体内可能发挥与哺乳动物不一样的生物学功能[5]。Fu等（2005）研究表明，经基因转染而表达的脂联素通过自分泌可促进脂肪细胞脂质的聚积[4]。本课题组试验结果：体外试验提示，新生荷斯坦乳用犊牛脂肪前体细胞ADPN mRNA上调脂肪细胞内脂肪蓄积，但当脂质蓄积到一定程度时，会呈现类似于人体肥胖时的脂联素低表达的现象[6]；奶牛的围产期间，ADPN可通过激素和代谢中间产物参与脂肪代谢的调节，提示ADPN可能是奶牛脂代谢中重要的调节因子[7]；延边黄牛与杂交肉牛脂联素的基因表达与肌内脂肪含量密切相关，但与遗传基础不同的其他肉牛是否具有同样的结果，尚需要进一步研究[8]。

本试验结果：延边黄牛、草原红牛眼肉脂肪含量24月龄时显著高于22月龄(P＜0.05)（见表3）。肌肉大理石纹主要决定于肌内脂肪的含量，从表5可见，延边黄牛、草原红牛22月龄时肌肉大理石纹均为3.5级，24月龄时大理石纹均为3级。提示，从22月龄到24月龄内，延边黄牛与草原红牛的ADPN mRNA水平与肌肉大理石纹有呈负相关的趋势。延边黄牛、草原红牛肌内脂肪含量从18月龄到22月龄期间增加（P＜0.05），ADPN mRNA水平也呈增加趋势（P＜0.05）。提示，在肉牛的育肥前期ADPN mRNA水平与肌肉大理石纹有正相关的趋势。延边黄牛、草原红牛的育肥阶段，从18月龄始前4个月，ADPN mRNA与肌内脂肪量均呈正相关（延边黄牛r=0.62；P＜0.001，n=9）、（草原红牛 r=0.78；P＜0.001），而肥育的后2个月，ADPN mRNA与肌内脂肪量均呈负相关（延边黄牛 r=-0.67；P＜0.001，n=9）和（草原红牛r=-0.81；P＜0.001，n=9）。是脂联素基因的表达量降低上调了肌内脂肪的沉积，还是肌内脂肪的沉积上调了脂联素基因表达的下降尚不明确。但是否提示可以将脂肪细胞因子脂联素作为肉牛肌内脂肪调控的一个后选基因，目前尚无相关文献报道。鉴于本试验样本数少，对脂联素基因表达与肉牛肌肉大理石纹的关系还有待于进一步研究。

4 结论

延边黄牛、草原红牛的ADPN mRNA水平在育肥的18月龄始到24月龄末阶段，前4个月与肌内脂肪含量均正相关，后2个月均呈负相关。提示，延边黄牛与草原红牛的ADPN mRNA水平与肌肉大理石纹均有相关性。