透明质酸对BALB/c小鼠激光损伤后皮肤屏障功能修复的研究

徐良恒 顾华 郭美华 刘海洋 刘付华 涂颖 庞勤 何黎

透明质酸对BALB/c小鼠激光损伤后皮肤屏障功能修复的研究

徐良恒 顾华 郭美华 刘海洋 刘付华 涂颖 庞勤 何黎

目的探讨透明质酸敷料促进BALB/c小鼠皮肤激光损伤后皮肤屏障修复的作用。方法36只清洁级雌性BALB/c小鼠均分为3组,每只小鼠用脱毛膏两侧背部脱毛后,用Q开关1064激光机,频率5 Hz,光斑3 mm,能量6 J的激光照射脱毛区后,每组分别外用基质、基质+胶原蛋白、基质+透明质酸于小鼠一侧背部,另一侧不做处理(阴性对照)。分别于6 h,24 h,7 d,21 d测试每只小鼠背部皮肤生理功能,并取每组3只小鼠皮损处皮肤做增殖细胞核抗原染色。结果与基质组和阴性对照比较,于第7天,基质+胶原蛋白组,基质+透明质酸组经表皮失水量值差异有统计学意义(P＜0.05),角质层含水量差异有统计学意义(P＜0.05),增殖细胞核抗原表达较强(P＜0.05)。24 h、1 d、21 d组间经表皮失水量、角质层含水量及增殖细胞核抗原表达强度差异无统计学意义(P＞0.05),第21天各组与造模前比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。各组小鼠皮肤屏障功能恢复正常。结论透明质酸敷料能促进BALB/c小鼠激光术后皮肤屏障功能修复,与胶原蛋白敷料作用相当。

激光;透明质酸;敷料,水胶体;皮肤,屏障;动物实验

随着医学激光技术的发展,激光被大量运用于医学领域,过去许多难治性的损容性皮肤病得到了很好的治疗,但在治疗过程中,激光的热效应及其他相关生物学效应会导致皮肤皮脂膜、皮肤“砖墙结构”等损害,不同程度地破坏皮肤的正常结构,导致皮肤屏障功能破坏[1]。激光术后常用冰敷术区降低皮肤水肿及不适,莫匹罗星软膏等外搽预防感染,但缺少一种能促进激光术后皮肤屏障恢复的产品。因此,本实验旨在观察透明质酸敷料对BALB/c小鼠激光术后皮肤屏障的修复效果,为临床应用提供参考依据。

材料与方法

一、试剂与仪器

仪器：美国HoYa-ConBio公司型号Medlite C6的激光仪,系Q开关1064 nm激光机。增殖细胞核抗原抗体(ab18197，1∶800),偶联辣根过氧化物酶的二抗及DAB显色剂(EnVision TM system)均购自丹麦Dako公司。

二、动物分组

清洁级雌性BALB/c小鼠40只,6周龄,平均体重(20±2)g,购自北京卫通利华实验动物技术有限公司,动物合格证号scxk(京)2012-0001。小鼠用人用脱毛膏两侧背部脱毛,约2 cm×2 cm区域。48 h后,取4只小鼠分别在脱毛处用Q开关1064激光机,频率5 Hz,光斑3 mm,能量分别为4 J、5 J、6 J、7 J的激光照射脱毛区。6 h后观察小鼠皮损处发红,水肿,结痂情况,并处死小鼠取皮损处皮肤做HE染色,选取皮肤外观有发红,水肿,表皮及真皮浅层较多炎症细胞浸润的能量6 J作为造模能量。用6 J的能量在脱毛48 h后的36只小鼠两侧背部造成激光术后皮肤模型,将小鼠分为基质组,基质+胶原蛋白(相对分子质量 ＜1 000,浓度为2%)组,基质+透明质酸(相对分子质量1 300 000,浓度0.2%)组,每组12只。

三、治疗

激光术后敷料(膏剂)均由昆明滇虹药业有限公司生产,滇妆生卫字(2011)0005号。每组小鼠选择一侧背部外用对应敷料,每只每次100 μl,一天两次,另一侧背部则不做处理(阴性对照)。造模后每周脱毛1次,于造模6 h,1 d,7 d,21 d每组处死3只小鼠并分别取处理侧及对照侧背部皮损。

四、方法

1.无创性皮肤测试：分别于造模前,造模后,造模6 h,1 d,7 d,21 d(测试前一天脱毛)测试小鼠两侧背部皮肤经表皮失水量(TEWL)及表皮含水量。所有检测均在室温为23～25℃,湿度为50%～60%的室内进行,每次在同一部位测量3次,取平均值。用TewameterTM仪(德国Courega+Khazaka公司)测量表皮 TEWL 值(g·h-1·cm-2),Moisture checker仪(日本Scalar公司)测量表皮含水量。

2.增殖细胞核抗原表达检测：4%甲醛固定,石蜡包埋,切片后脱蜡,用3%过氧化氢室温孵育10 min后,用0.01 mol/L枸橼酸钠抗原修复液,高压法抗原修复5 min后,用5%封闭用绵羊血清封闭30 min。加一抗,4℃过夜。加二抗,37℃孵育30 min。各步骤间均以PBS漂洗3次,每次5 min,DAB显色后脱水,透明、封片。光镜下观察增殖细胞核抗原阳性表达率。阳性物质呈棕黄色颗粒状,主要位于细胞核,参考文献[2-3]方法：观察基底层60个高倍视野(每个标本随机观察5个视野)。染色强度评分：0分为无色,1分为细胞染色呈浅黄色(轻度),2分为细胞染色呈黄色(中度),3分为细胞染色呈棕褐色(重度)。以阳性细胞百分率来判定,无阳性细胞表达计0,阳性细胞数为l%～25%计1分,阳性细胞数为26%～50%计2分,阳性细胞数为51%～75%计3分,阳性细胞数为75%～100%计4分。上面两项相加为分级标准：阴性计0～1分,弱阳性(+)计2～3分,阳性(++)计4～5分,强阳性(+++)计6～7分。由病理科医师连续读片。

3.统计方法：无创性皮肤测试结果用单因素方差分析ANOVA;增殖细胞核抗原的表达用秩和检验及χ2检验,相关分析用Spearman等级相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、无创性皮肤测试

6 h,1 d,7 d,21 d,每组小鼠做无创性皮肤生理功能测试,相同时间点每组间相互比较,基质组与阴性对照间,差异均无统计学意义(P＞0.05),第7天,基质+胶原蛋白组与基质+透明质酸组间差异无统计学意义,两组与基质组间差异统计学意义(P＜0.05)。见表1,2。

二、增殖细胞核抗原

增殖细胞核抗原主要位于细胞核,皮肤阳性反应部位主要以基底层为主,细胞核染为棕黄色。比较每组相同时间点组间增殖细胞核抗原表达强弱。于第7天,基质+胶原蛋白组与基质+透明质酸组增殖细胞核抗原表达强度增强。见图1。

讨 论

敷料能与创面紧密粘连,为创面提供湿润,低氧/无氧、微酸,酶学清创的愈合环境,与局部应用的药物和机体内源性分子相作用,促进伤口愈合[4]。透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种广泛分布于人和动物体内的大分子酸性黏多糖,能调节表皮角质形成细胞[5],促进创伤愈合、调控胶原合成、抗炎等作用[6],外用能调节伤口过度收缩,减少瘢痕形成[7],能在表皮形成水化膜,保持皮肤水分,加强和维持角质层吸水能力及屏障功能。在刘付华等[8]的临床观察证实,透明质酸修护生物膜具有恢复皮肤屏障的功能和良好的保湿作用。胶原蛋白有引导上皮细胞迁入缺损区的能力,还可诱导产生趋化因子如血小板生长因子和纤维连接蛋白等,从而对细胞的生长有趋化作用,与皮肤损伤的修复密切相关。胶原蛋白贴敷料提供了皮肤潮湿、微酸性的微环境,在皮肤科有广泛的应用[9]。临床也常将胶原蛋白贴敷料用于激光术后,促进创面愈合,恢复皮肤屏障功能,杨斌等[10]运用胶原蛋白贴敷料配合微晶磨疤机及激光、光子的治疗取得较好的临床效果。

表1 各组小鼠皮肤含水量(x±s)%

表2 各组小鼠皮肤经表皮失水量值(x±s)g·h-1·cm-2

图1 实验第7天,小鼠皮肤增殖细胞核抗原染色(细胞核染色),基质+胶原蛋白组与基质+透明质酸组表皮较阴性对照与基质组厚,增殖细胞核抗原表达较两对照组强(免疫组化×200) 1a：阴性对照组;1b：基质组;1c：基质+胶原蛋白;1d：基质+透明质酸

本实验构建了激光术后真皮浅层损伤、皮肤屏障破坏的小鼠动物模型,分别观察了外用敷料基质,基质+胶原蛋白,基质 +透明质酸对皮肤屏障修复情况。皮肤屏障保持皮肤的水分,维持正常的生理功能,激光术后皮肤屏障损伤。TEWL测定的是通过皮肤扩散入外界环境的水分,是反映皮肤屏障功能的一个重要参数,可反映出皮肤屏障损伤程度,其值越高表示皮肤屏障受损越严重,角质层含水量可反映皮肤屏障功能,两指标用于评价皮肤屏障修复情况[11]。6 h、24 h各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。于第7天,基质+胶原蛋白组与基质+透明质酸组皮肤含水量较基质组与阴性对照高,TEWL值较其低,差异有统计学意义(P＜0.05),而两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。证明其能促进皮肤屏障功能修复,第21天,各组与造模前比较,角质层含水量及TEWL值差异无统计学意义(P＞0.05),小鼠屏障功能恢复。增殖细胞核抗原[12]又称细胞周期蛋白或周期素,是一种相对分子质量36 000、酸性、无组蛋白的细胞核多肽,是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白,它的表达合成与增殖细胞的增殖周期有关,是DNA聚合酶的辅助蛋白,参与调节DNA的合成,是DNA复制过程中所必需的。增殖细胞核抗原可作为细胞增殖的特异性标记,反映细胞的增殖活性。第7天,外用透明质酸敷料组与胶原蛋白敷料组角质层较对照组厚,增殖细胞核抗原表达增强,证明其对皮肤屏障修复有促进作用。

本实验通过构建BALB/c小鼠激光术后皮肤动物模型并外用透明质酸敷料与胶原蛋白敷料进行对比观察,证实了透明质酸敷料能促进激光术后皮肤屏障恢复,作用与临床广泛使用的胶原蛋白敷料相当。

[1] 涂颖，何黎.激光治疗对皮肤的损伤及护理[J].临床皮肤科杂志，2008，37(8):548-550.

[2]Hannuksela-Svahn A，Pääkkö P，Autio P，et al.Expression of p53 protein before and after PUVA treatment in psoriasis[J].Acta Derm Venereol，1999，79(3):195-199.

[3]Kawahira K.Immunohistochemical staining of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)in malignant and nonmalignant skin diseases[J].Arch Dermatol Res，1999，291(7-8):413-418.

[4] 赵亮，李敏.创面生物敷料及人工皮肤的研究进展[J].福建师范大学学报(自然科学版)，2011，27(1):120-124.

[5]Huang L，Gu H，Burd A.A reappraisal of the biological effects of hyaluronan on human dermal fibroblast[J].J Biomed Mater Res A，2009，90(4):1177-1185.

[6]涂颖，顾华，何黎.透明质酸在皮肤病发病机制中的研究进展[J].临床皮肤科杂志，2012，41(3):192-194.

[7]Gu H，Huang L，Wong YP，et al.HA modulation of epidermal morphogenesisin an organotypic keratinocyte-fibroblastcoculture model[J].Exp Dermatol，2010，19(8):e336-e339.

[8] 刘付华，施为，乌日娜，等.透明质酸生物膜辅助治疗干燥性湿疹的多中心对照研究[J].中华皮肤科杂志，2013，46(6):433-436.

[9] 孙玮杰，周志刚，王百顺.外用胶原蛋白敷料面膜及皮肤止痒脱敏膜治疗面部激素依赖性皮炎临床观察[J].中华皮肤科杂志，2010，43(10):748.

[10] 杨斌，陈抗.胶原蛋白贴敷料在美容皮肤的临床研究[J].中国热带医学，2005，5(4):803-804.

[11] 邹菥，杨成，何黎，等.面部痤疮，湿疹，黄褐斑及日光皮炎皮肤屏障功能评价及其临床意义[J].中华皮肤科杂志，2013，46(1):29-32.

[12]Barnouti ZP，Owtad P，Shen G，et al.The biological mechanisms of PCNA and BMP in TMJ adaptive remodeling[J].Angle Orthod，2011，81(1):91-99.

2013-07-18)

(本文编辑：吴晓初)

Restoring effect of hyaluronic acid on impaired skin barrier function in BALB/c mice after laser irradiation

Xu Liangheng*，Gu Hua，Guo Meihua，Liu Haiyang，Liu Fuhua，Tu Ying，Pang Qin，He Li.*First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Collaborative Innovation Center of Yunnan Province,Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province,Kunming 650032，China

He Li，Email:heli2662@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the restoring effect of dressings containing hyaluronic acid on impaired skin barrier function in BALB/c mice after laser irradiation.MethodsThe back of 63 BALB/c female mice were shaved with depilatory cream followed by exposure to Q-switched 1064-laser(frequency，5 Hz;light spot，3 mm;energy，6 J).Then，the mice were randomly and equally divided into three groups to be topically treated with dressings containing vehicle，vehicle+collagen protein and vehicle+hyaluronan acid respectively twice a day for 21 days.The dressings were only applied at one side of the back of these mice，and the other side was left untreated to serve as a negative control.Skin physiological parameters were measured on the back of these mice at 6 hours，24 hours，7 days，and 21 days after the beginning of treatment，and 3 mice were sacrificed in each group at every time points.Skin tissue specimens were obtained from the back of sacrificed mice followed by immunohistochemistry for the detection of proliferating cell nuclear antigen(PCNA).ResultsOn the 7th day，the vehicle+collagen protein group and vehicle+hyaluronan acid group showed lower TEWL values((13.9±0.9)and(12.6±0.6)vs.(18.4±0.4)and(18.4 ± 0.5)g·h-1·cm-2，allP＜ 0.05)，but increased water content in stratum corneum(33.6% ± 0.1%and 33.7%±0.1%vs.25.4%±0.2%and 26.5%±1.3%，allP＜0.05)and PCNA expression compared with the vehicle group and negative control group(side).However，no significant difference was observed between these groups in any of the above parameters at 24 hours，1 day，or 21 days after the beginning of treatment(allP＞ 0.05).Additionally，all the parameters returned to the preirradiation levels on the 21stday in all the three groups(allP＞0.05)with the recovery of skin barrier function.ConclusionsThe effects of dressings containing collagen protein and those containing hyaluronic acid are comparable on the restoration of impaired skin barrier function in BALB/c mice after laser irradiation.

Laser;Hyaluronic acid;Bandages，hydrocolloid;Skin，barrier;Animal experimentation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.011

教育部2013年度“创新团队发展计划”(IRT13067);云南省卫生高层次人才培养计划(L-201211)

650032昆明医科大学第一附属医院、云南省协同创新中心、云南省工程技术研究中心(徐良恒、顾华、刘付华、涂颖、何黎);昆明医科大学(郭美华);中国科学院昆明植物研究所(刘海洋);昆明薇诺娜皮肤医疗美容中心(庞勤)

何黎,Email：heli2662@hotmail.com